Pan-Cadherin Antibody [J6A2] Datasheet

生物描述

特异性	Pan-Cadherin Antibody [J6A2] 可检测内源性 Pan-Cadherin 总蛋白水平。
背景	泛钙黏蛋白是指能够识别经典钙黏蛋白（E-、N-、P-、VE-钙黏蛋白）中保守的细胞外钙黏蛋白（EC）结构域的抗体。经典钙黏蛋白是单次跨膜糖蛋白，介导Ca²⁺依赖的同型细胞间黏附，这对组织形态发生、屏障完整性和连接信号传导至关重要。每个钙黏蛋白单体都具有一个前结构域切割的 N 端、五个串联的 EC 重复序列（约 110 个残基的 β-三明治希腊钥匙拓扑结构，在 EC1-2/EC2-3/EC3-4 连接子处有 Ca²⁺ 结合位点，使棒状胞外结构域刚性化为约 90° 的弯曲）、一个单跨膜螺旋和一个保守的胞质尾，该胞质尾可募集 p120-catenin、β-catenin、α-catenin 和 plakoglobin 将连接点锚定到 F-肌动蛋白上。它表现出拉链式黏附：EC1 N端链交换（Trp2 βB链插入伴侣EC1受体口袋）形成跨同型键（亲和力约为10⁻⁷ M），需要Ca²⁺诱导的刚性；同时，通过EC1疏水斑块和EC4界面的侧向顺式二聚化，使每个连接处聚集约200个钙黏蛋白。连环蛋白介导的张力转导激活YAP/β-连环蛋白信号通路和Rho GTP酶收缩性（导致皮层张力增加约2倍）。泛钙黏蛋白维持上皮极性（顶端黏附连接）、内皮屏障功能（VE-钙黏蛋白机械感知）、神经元分层（N-钙黏蛋白突触稳定）以及EMT抑制（E-钙黏蛋白丢失导致N-钙黏蛋白转换）。钙黏蛋白转换（E-钙黏蛋白↓/N-钙黏蛋白↑）通过MMP9/FGFR协同作用驱动约80%的癌细胞侵袭；突变是先天性心脏缺陷（HLHS）、致盲性营养不良（P-钙黏蛋白）和肿瘤转移的根本原因，而治疗性钙黏蛋白模拟物可以恢复炎症性疾病中的屏障功能。

特异性

Pan-Cadherin Antibody [J6A2] 可检测内源性 Pan-Cadherin 总蛋白水平。

背景

泛钙黏蛋白是指能够识别经典钙黏蛋白（E-、N-、P-、VE-钙黏蛋白）中保守的细胞外钙黏蛋白（EC）结构域的抗体。经典钙黏蛋白是单次跨膜糖蛋白，介导Ca²⁺依赖的同型细胞间黏附，这对组织形态发生、屏障完整性和连接信号传导至关重要。每个钙黏蛋白单体都具有一个前结构域切割的 N 端、五个串联的 EC 重复序列（约 110 个残基的 β-三明治希腊钥匙拓扑结构，在 EC1-2/EC2-3/EC3-4 连接子处有 Ca²⁺ 结合位点，使棒状胞外结构域刚性化为约 90° 的弯曲）、一个单跨膜螺旋和一个保守的胞质尾，该胞质尾可募集 p120-catenin、β-catenin、α-catenin 和 plakoglobin 将连接点锚定到 F-肌动蛋白上。它表现出拉链式黏附：EC1 N端链交换（Trp2 βB链插入伴侣EC1受体口袋）形成跨同型键（亲和力约为10⁻⁷ M），需要Ca²⁺诱导的刚性；同时，通过EC1疏水斑块和EC4界面的侧向顺式二聚化，使每个连接处聚集约200个钙黏蛋白。连环蛋白介导的张力转导激活YAP/β-连环蛋白信号通路和Rho GTP酶收缩性（导致皮层张力增加约2倍）。泛钙黏蛋白维持上皮极性（顶端黏附连接）、内皮屏障功能（VE-钙黏蛋白机械感知）、神经元分层（N-钙黏蛋白突触稳定）以及EMT抑制（E-钙黏蛋白丢失导致N-钙黏蛋白转换）。钙黏蛋白转换（E-钙黏蛋白↓/N-钙黏蛋白↑）通过MMP9/FGFR协同作用驱动约80%的癌细胞侵袭；突变是先天性心脏缺陷（HLHS）、致盲性营养不良（P-钙黏蛋白）和肿瘤转移的根本原因，而治疗性钙黏蛋白模拟物可以恢复炎症性疾病中的屏障功能。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

130-150 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A431, Lane 2: PANC-1, Lane 3: C2C12, Lane 4: SH-SY5Y