PDK1 Antibody [M15P23] Datasheet

生物描述

特异性	PDK1 Antibody [M15P23] 可检测内源性 PDK1 总蛋白水平。
背景	PDK1 是一种由 556 个氨基酸组成的 AGC 家族丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过磷酸化 20 多种 AGC 激酶（包括 Akt 或 PKB、p70S6K、RSK、SGK 和 PKC 亚型）的 T 环或激活片段，发挥上游激活因子的作用，从而整合 PI3K 信号通路，调控细胞存活、增殖和代谢。PDK1 由一个 N 端催化激酶结构域组成，该结构域包含 1 至 350 个氨基酸，呈双叶状，其上有一个由 Leu155、Val158 和 Phe160 形成的 PIF 口袋疏水裂隙，该裂隙位于激活环磷酸结合位点附近，Arg129、Arg131 和 Glu130 在此处与 pSer241 和一个硫酸盐类似物配位。 C端pleckstrin同源PH结构域（氨基酸411至545）具有典型的七链β-三明治结构以及一个α螺旋“出芽”折叠，其碱性口袋可通过Lys535和Arg531结合PtdIns(3,4,5)P3或PtdIns(3,4)P2。PDK1是一种双模式底物激活蛋白：在膜募集模式下，PIP3或PIP2以约十倍的亲和力与PH结构域结合，使PDK1与PIP3结合的Akt共定位，并将疏水基序FxxFS、TF或Y募集到PIF口袋中，诱导构象变化，从而暴露T环，使其在Akt的Ser473或S6K1的Thr229等残基上发生磷酸化。在胞质停靠模式下，S6K、RSK 或 SGK 的磷酸化疏水基序通过变构作用与 PIF 口袋结合，即使在没有 PIP3 的情况下也能激活约 100 倍。PDK1 通过 PI3K-PIP3-Akt-mTORC1 通路传递胰岛素和 IGF1 等生长因子信号，驱动葡萄糖摄取、糖原合成和蛋白质翻译，同时其通过 Ser241 自磷酸化维持的组成型活性则维持 AGC 激酶的基础活性。PDK1 在包括胰腺癌和乳腺癌在内的多种癌症中发生扩增或过表达，这通常是由于 17q21 扩增所致。靶向 PDK1 的抑制剂可与 PI3K 或 mTOR 抑制剂协同作用，诱导 PTEN 缺失肿瘤细胞凋亡。

特异性

PDK1 Antibody [M15P23] 可检测内源性 PDK1 总蛋白水平。

背景

PDK1 是一种由 556 个氨基酸组成的 AGC 家族丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过磷酸化 20 多种 AGC 激酶（包括 Akt 或 PKB、p70S6K、RSK、SGK 和 PKC 亚型）的 T 环或激活片段，发挥上游激活因子的作用，从而整合 PI3K 信号通路，调控细胞存活、增殖和代谢。PDK1 由一个 N 端催化激酶结构域组成，该结构域包含 1 至 350 个氨基酸，呈双叶状，其上有一个由 Leu155、Val158 和 Phe160 形成的 PIF 口袋疏水裂隙，该裂隙位于激活环磷酸结合位点附近，Arg129、Arg131 和 Glu130 在此处与 pSer241 和一个硫酸盐类似物配位。 C端pleckstrin同源PH结构域（氨基酸411至545）具有典型的七链β-三明治结构以及一个α螺旋“出芽”折叠，其碱性口袋可通过Lys535和Arg531结合PtdIns(3,4,5)P3或PtdIns(3,4)P2。PDK1是一种双模式底物激活蛋白：在膜募集模式下，PIP3或PIP2以约十倍的亲和力与PH结构域结合，使PDK1与PIP3结合的Akt共定位，并将疏水基序FxxFS、TF或Y募集到PIF口袋中，诱导构象变化，从而暴露T环，使其在Akt的Ser473或S6K1的Thr229等残基上发生磷酸化。在胞质停靠模式下，S6K、RSK 或 SGK 的磷酸化疏水基序通过变构作用与 PIF 口袋结合，即使在没有 PIP3 的情况下也能激活约 100 倍。PDK1 通过 PI3K-PIP3-Akt-mTORC1 通路传递胰岛素和 IGF1 等生长因子信号，驱动葡萄糖摄取、糖原合成和蛋白质翻译，同时其通过 Ser241 自磷酸化维持的组成型活性则维持 AGC 激酶的基础活性。PDK1 在包括胰腺癌和乳腺癌在内的多种癌症中发生扩增或过表达，这通常是由于 17q21 扩增所致。靶向 PDK1 的抑制剂可与 PI3K 或 mTOR 抑制剂协同作用，诱导 PTEN 缺失肿瘤细胞凋亡。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Hamster, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

58-68 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 2R75, Lane 2: MCF-7, Lane 3: COS-7, Lane 4: 3T3