Peroxiredoxin 6 Antibody [G12J13]

目录号：F2838

打印

生物描述

特异性 Peroxiredoxin 6 Antibody [G12J13] 可检测内源性 Peroxiredoxin 6 总蛋白水平。
背景 过氧化物酶6 (Prdx6) 是一种独特的25 kDa单半胱氨酸过氧化物酶，几乎在所有组织中均有表达，但在肺部高度富集。它独特地将强大的过氧化物酶和磷脂酶A2 (PLA2) 样活性结合在一个由224个氨基酸组成的多肽中。其N端硫氧还蛋白折叠结构域将过氧化物酶活性半胱氨酸残基Cys47置于一个疏水性口袋中，使其能够以谷胱甘肽 (GSH) 为主要还原剂，高效还原H₂O₂、短链有机氢过氧化物和磷脂氢过氧化物。同时，其独特的表面PLA2催化位点（His26-Ser32-Asp140三联体和GDSWG基序）能够水解氧化磷脂的sn-2酰基链。 Prdx6 在还原型单体（有利于过氧化物酶活性）和氧化型二聚体（增强 PLA2 功能）之间交替存在，从而能够快速适应氧化应激和脂质应激。通过这种双重机制，Prdx6 不仅能够维持氧化还原平衡和膜完整性，尤其是在肺表面活性物质代谢中，还能通过将 PLA2 介导的磷脂水解与溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 (LPCAT) 的再酰化偶联，促进完全修复。Prdx6 调节 H₂O₂ 信号传导并激活 NADPH 氧化酶 2 (Nox2) 以参与炎症反应，并与硫氧还蛋白网络相互作用。其调控涉及 Nrf2 驱动的转录、pH 依赖性活性转换（中性 pH 下为过氧化物酶活性，酸性 pH 下为 PLA2 活性）、磷酸化和谷胱甘肽化，以及应激诱导的向线粒体、溶酶体或质膜的转位。 Prdx6 失调与多种病理有关，包括癌症（通过 NF-κB 驱动的生长、侵袭和治疗耐药性）、神经退行性疾病（影响氧化损伤和 Tau 聚集）、炎症、骨质疏松症、糖尿病、白内障和不孕症。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 - 1:10000 1:250 - 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 25 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293T, Lane 2: A431, Lane 3: Mouse liver, Lane 4: Rat liver