PEX5 Antibody [L22A16] Datasheet

生物描述

特异性	PEX5 Antibody [L22A16] 可检测内源性 PEX5 总蛋白水平。
背景	PEX5是过氧化物酶体靶向信号1 (PTS1) 基质蛋白的主要胞质受体，属于过氧化物酶体蛋白家族，对细胞器生物合成至关重要。该蛋白具有固有无序的N端结构域，其中包含五肽基序和两亲性螺旋，可与对接过氧化物酶体蛋白PEX14和PEX13相互作用。其C端四肽重复序列 (TPR) 结构域形成六螺旋束，负责识别货物蛋白（例如过氧化氢酶）的C端PTS1三肽。在胞质中，PEX5捕获折叠的PTS1货物，并通过其较长的亚型PEX5L与PEX7/PTS2复合物结合。随后，它通过与PEX14相互作用而对接至过氧化物酶体膜。货物转运至基质的过程发生在PEX5插入膜的过程中，此时PEX5呈现跨膜拓扑结构，其N端暴露于胞质中。在此，PEX5 在 PEX4/PEX22 和 E3 泛素连接酶 PEX12 的作用下，于一个保守的半胱氨酸残基上发生单泛素化修饰。该泛素标签启动受体输出模块 PEX1/PEX6 AAA ATPase 和 PEX26 的提取，这些酶解开 PEX5 并将其释放到过氧化物酶体基质中。单泛素化的 PEX5 比未修饰的 PEX5 与输出组分结合更紧密，从而确保快速循环和持续的输入循环。该过程对于维持过氧化物酶体动力学、脂质代谢和活性氧 (ROS) 解毒至关重要，因为它能维持基质酶的水平。PEX5 还通过锚定 PEX7 间接参与 PTS2 蛋白的输入，从而协调双重靶向通路。 PEX5泛素化或结构域突变等功能障碍会损害其导入，并导致过氧化物酶体生物合成障碍，例如泽尔维格综合征。该综合征的特征是严重的神经系统缺陷、肌张力低下以及由于酶缺乏而导致的早期死亡。PEX5循环的改变会通过损害过氧化物酶体β-氧化而影响活性氧（ROS）信号传导和肿瘤进展。

特异性

PEX5 Antibody [L22A16] 可检测内源性 PEX5 总蛋白水平。

背景

PEX5是过氧化物酶体靶向信号1 (PTS1) 基质蛋白的主要胞质受体，属于过氧化物酶体蛋白家族，对细胞器生物合成至关重要。该蛋白具有固有无序的N端结构域，其中包含五肽基序和两亲性螺旋，可与对接过氧化物酶体蛋白PEX14和PEX13相互作用。其C端四肽重复序列 (TPR) 结构域形成六螺旋束，负责识别货物蛋白（例如过氧化氢酶）的C端PTS1三肽。在胞质中，PEX5捕获折叠的PTS1货物，并通过其较长的亚型PEX5L与PEX7/PTS2复合物结合。随后，它通过与PEX14相互作用而对接至过氧化物酶体膜。货物转运至基质的过程发生在PEX5插入膜的过程中，此时PEX5呈现跨膜拓扑结构，其N端暴露于胞质中。在此，PEX5 在 PEX4/PEX22 和 E3 泛素连接酶 PEX12 的作用下，于一个保守的半胱氨酸残基上发生单泛素化修饰。该泛素标签启动受体输出模块 PEX1/PEX6 AAA ATPase 和 PEX26 的提取，这些酶解开 PEX5 并将其释放到过氧化物酶体基质中。单泛素化的 PEX5 比未修饰的 PEX5 与输出组分结合更紧密，从而确保快速循环和持续的输入循环。该过程对于维持过氧化物酶体动力学、脂质代谢和活性氧 (ROS) 解毒至关重要，因为它能维持基质酶的水平。PEX5 还通过锚定 PEX7 间接参与 PTS2 蛋白的输入，从而协调双重靶向通路。 PEX5泛素化或结构域突变等功能障碍会损害其导入，并导致过氧化物酶体生物合成障碍，例如泽尔维格综合征。该综合征的特征是严重的神经系统缺陷、肌张力低下以及由于酶缺乏而导致的早期死亡。PEX5循环的改变会通过损害过氧化物酶体β-氧化而影响活性氧（ROS）信号传导和肿瘤进展。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

80 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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