PFKFB3 Antibody [A21K14] Datasheet

生物描述

特异性	PFKFB3 Antibody [A21K14] 可检测内源性 PFKFB3 总蛋白水平。
背景	PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3）是一种双功能酶，它通过调节细胞内果糖-2,6-二磷酸（F2,6BP）的水平，在糖酵解调控中发挥关键作用。F2,6BP是磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的强效变构激活剂，而PFK-1是糖酵解的主要限速酶。PFKFB3以同源二聚体的形式存在，每个亚基包含一个N端激酶结构域和一个C端二磷酸酶结构域。N端激酶结构域能够利用果糖-6-磷酸（F6P）和ATP合成F2,6BP；C端二磷酸酶结构域则能够将F2,6BP降解为F6P和无机磷酸盐。PFKFB3的激酶活性远高于其磷酸酶活性，从而显著促进糖酵解通量。 PFKFB3 的表达在缺氧诱导因子 (HIF) 的强烈诱导下显著上调，尤其是在低氧条件下，以增强糖酵解并满足增加的能量需求。PFKFB3 作为一种代谢开关，整合糖酵解和合成代谢途径，协调能量产生和生物合成过程，这对于细胞在代谢应激期间的增殖和存活至关重要。F2,6BP 水平升高可变构激活 PFK-1，驱动 F6P 不可逆地转化为果糖-1,6-二磷酸，从而加速糖酵解和 ATP 的生成。PFKFB3 还调节磷酸戊糖途径，影响氧化还原平衡和核苷酸合成，这对细胞生长至关重要。其活性还受到翻译后修饰的进一步调控，例如 Ser461 位点的磷酸化可增强其激酶活性。 PFKFB3 的上调驱动癌症中的瓦博格效应，通过维持高糖酵解率促进肿瘤生长、血管生成和转移，并且通过破坏葡萄糖稳态导致糖尿病等代谢性疾病。

特异性

PFKFB3 Antibody [A21K14] 可检测内源性 PFKFB3 总蛋白水平。

背景

PFKFB3（6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3）是一种双功能酶，它通过调节细胞内果糖-2,6-二磷酸（F2,6BP）的水平，在糖酵解调控中发挥关键作用。F2,6BP是磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的强效变构激活剂，而PFK-1是糖酵解的主要限速酶。PFKFB3以同源二聚体的形式存在，每个亚基包含一个N端激酶结构域和一个C端二磷酸酶结构域。N端激酶结构域能够利用果糖-6-磷酸（F6P）和ATP合成F2,6BP；C端二磷酸酶结构域则能够将F2,6BP降解为F6P和无机磷酸盐。PFKFB3的激酶活性远高于其磷酸酶活性，从而显著促进糖酵解通量。 PFKFB3 的表达在缺氧诱导因子 (HIF) 的强烈诱导下显著上调，尤其是在低氧条件下，以增强糖酵解并满足增加的能量需求。PFKFB3 作为一种代谢开关，整合糖酵解和合成代谢途径，协调能量产生和生物合成过程，这对于细胞在代谢应激期间的增殖和存活至关重要。F2,6BP 水平升高可变构激活 PFK-1，驱动 F6P 不可逆地转化为果糖-1,6-二磷酸，从而加速糖酵解和 ATP 的生成。PFKFB3 还调节磷酸戊糖途径，影响氧化还原平衡和核苷酸合成，这对细胞生长至关重要。其活性还受到翻译后修饰的进一步调控，例如 Ser461 位点的磷酸化可增强其激酶活性。 PFKFB3 的上调驱动癌症中的瓦博格效应，通过维持高糖酵解率促进肿瘤生长、血管生成和转移，并且通过破坏葡萄糖稳态导致糖尿病等代谢性疾病。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

60 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HepG2, Lane 2: Hela, Lane 3: INS-1, Lane 4: COS-7