PHC1 Antibody (Mouse mAb) [F8N11] Datasheet

生物描述

特异性	PHC1 Antibody (Mouse mAb) [F8N11] 可检测内源性 PHC1 总蛋白水平。
背景	多聚异型蛋白 1 (PHC1) 是 PRC1 样复合物的典型多梳蛋白组成分，它通过促进染色质压缩和稳定发育调控位点（包括 Hox 基因簇和细胞周期控制基因）的抑制结构域，从而促进长期基因沉默和染色质组织。该蛋白包含一个N端FCS锌指区和一个C端无菌α基序（SAM）寡聚化结构域。PRC1模型描述了PHC1 SAM驱动的PRC1复合物沿染色质聚合，这是高级染色质凝聚和可遗传抑制的关键结构特征，与Ring1A/B介导的组蛋白H2A赖氨酸119位点的单泛素化互补。在胚胎干细胞中，PHC1参与经典的PRC1复合物，该复合物通过CBX亚基读取PRC2沉积的H3K27me3，然后压缩染色质并沉默发育基因。但PHC1也参与非经典的PRC1样复合物，并与多能性因子NANOG直接相互作用，在Nanog基因座周围组织全基因组染色质接触，并维持高水平的Nanog转录，进而维持……多能性与自我更新能力密切相关。在小鼠胚胎干细胞中敲低或敲除PHC1会降低Nanog及其下游靶基因的表达，损害Nanog基因座的空间染色质构象，并削弱多能性；而异位表达Nanog可部分挽救这些缺陷，表明PHC1具有双重功能：一方面，通过PRC1依赖的H2AK119ub和染色质致密化抑制分化基因的表达；另一方面，通过稳定长程染色质相互作用正向调控Nanog的转录。人类遗传学数据表明，PHC1与常染色体隐性遗传性原发性小头畸形（MCPH11）相关。在患有先天性小头畸形、脑容量小但结构正常、认知功能低下或正常的同胞兄弟姐妹中，发现了PHC1基因的纯合L992F错义突变。携带L992F突变的患者成纤维细胞显示正常的PHC1 mRNA水平，但由于蛋白酶体介导的降解，PHC1蛋白显著减少；复制许可抑制因子Geminin水平升高；PHC1与泛素化H2A的结合减少；以及H2AK119单泛素化存在显著缺陷。所有这些改变均可通过PHC1 siRNA重现，并可通过野生型PHC1过表达得到恢复。这些细胞表现出异常的细胞周期分布，与神经祖细胞增殖活性降低、辐射后DNA损伤增加和DNA修复缺陷以及细胞周期调控相关基因的广泛失调相一致。这些结果进一步证实了PHC1介导的染色质重塑和H2AK119泛素依赖性抑制对于早期神经发生过程中增殖和分化的平衡以及在皮层快速扩张过程中维持基因组完整性至关重要。

特异性

PHC1 Antibody (Mouse mAb) [F8N11] 可检测内源性 PHC1 总蛋白水平。

背景

多聚异型蛋白 1 (PHC1) 是 PRC1 样复合物的典型多梳蛋白组成分，它通过促进染色质压缩和稳定发育调控位点（包括 Hox 基因簇和细胞周期控制基因）的抑制结构域，从而促进长期基因沉默和染色质组织。该蛋白包含一个N端FCS锌指区和一个C端无菌α基序（SAM）寡聚化结构域。PRC1模型描述了PHC1 SAM驱动的PRC1复合物沿染色质聚合，这是高级染色质凝聚和可遗传抑制的关键结构特征，与Ring1A/B介导的组蛋白H2A赖氨酸119位点的单泛素化互补。在胚胎干细胞中，PHC1参与经典的PRC1复合物，该复合物通过CBX亚基读取PRC2沉积的H3K27me3，然后压缩染色质并沉默发育基因。但PHC1也参与非经典的PRC1样复合物，并与多能性因子NANOG直接相互作用，在Nanog基因座周围组织全基因组染色质接触，并维持高水平的Nanog转录，进而维持……多能性与自我更新能力密切相关。在小鼠胚胎干细胞中敲低或敲除PHC1会降低Nanog及其下游靶基因的表达，损害Nanog基因座的空间染色质构象，并削弱多能性；而异位表达Nanog可部分挽救这些缺陷，表明PHC1具有双重功能：一方面，通过PRC1依赖的H2AK119ub和染色质致密化抑制分化基因的表达；另一方面，通过稳定长程染色质相互作用正向调控Nanog的转录。人类遗传学数据表明，PHC1与常染色体隐性遗传性原发性小头畸形（MCPH11）相关。在患有先天性小头畸形、脑容量小但结构正常、认知功能低下或正常的同胞兄弟姐妹中，发现了PHC1基因的纯合L992F错义突变。携带L992F突变的患者成纤维细胞显示正常的PHC1 mRNA水平，但由于蛋白酶体介导的降解，PHC1蛋白显著减少；复制许可抑制因子Geminin水平升高；PHC1与泛素化H2A的结合减少；以及H2AK119单泛素化存在显著缺陷。所有这些改变均可通过PHC1 siRNA重现，并可通过野生型PHC1过表达得到恢复。这些细胞表现出异常的细胞周期分布，与神经祖细胞增殖活性降低、辐射后DNA损伤增加和DNA修复缺陷以及细胞周期调控相关基因的广泛失调相一致。这些结果进一步证实了PHC1介导的染色质重塑和H2AK119泛素依赖性抑制对于早期神经发生过程中增殖和分化的平衡以及在皮层快速扩张过程中维持基因组完整性至关重要。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	ChIP
1:1000	1:50	1:50

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

106 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

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