PHGDH Antibody (Mouse mAb) [H19P14]

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生物描述

特异性 PHGDH Antibody (Mouse mAb) [H19P14] 可检测内源性 PHGDH 总蛋白水平。
背景 磷酸甘油酸脱氢酶 (PHGDH) 是一种 D-异构体特异性 2-羟基酸脱氢酶，催化 3-磷酸-D-甘油酸可逆氧化为 3-磷酸氧丙酮酸，这是磷酸化 L-丝氨酸生物合成途径的第一个关键步骤，并将糖酵解中间体与氨基酸、核苷酸和脂质前体的生成联系起来。该酶属于 D-特异性 2-羟基酸脱氢酶家族，以 NAD⁺/NADH 为辅因子，定位于细胞质和线粒体中。在细胞质和线粒体中，它以同源二聚体脱氢酶的形式发挥作用，不稳定地整合到大型多酶复合物中，转化支持细胞生长、生物质积累和氧化还原平衡的底物。除了对 3-磷酸甘油酸的经典活性外，人 PHGDH 还催化 NADH 依赖的 α-酮戊二酸还原为致癌代谢物 D-2-羟基戊二酸，并催化 2-羟基戊二酸可逆氧化为 2-酮戊二酸和 (S)-苹果酸可逆氧化为草酰乙酸，这表明其底物混杂性将丝氨酸合成与三羧酸 (TCA) 循环中间体和 2-羟基酸代谢联系起来。结构和酶学研究表明，PHGDH扩增的乳腺癌细胞系（如MDA-MB-468和BT-20）中D-2-羟基戊二酸的浓度可达数十微摩尔级。PHGDH敲低可使细胞内2-羟基戊二酸的含量降低约一半，而重新表达具有催化活性的PHGDH可逆转这一效应，但失活突变体则不能。这表明PHGDH的脱氢酶活性直接在这些肿瘤中产生这种致癌代谢物。在PHGDH低表达的乳腺癌细胞中过表达PHGDH可使2-羟基戊二酸的含量增加两倍以上，进一步证实了PHGDH丰度与这种最初与突变型异柠檬酸脱氢酶相关的代谢物积累之间的联系，并将PHGDH的生化功能从丝氨酸途径扩展到表观遗传活性致癌代谢物的生成。作为从头合成L-丝氨酸的限速酶，PHGDH控制着L-丝氨酸的供应，而L-丝氨酸是D-丝氨酸的前体。D-丝氨酸是NMDA受体的主要激动剂，并为核苷酸、磷脂和谷胱甘肽的合成提供碳和一碳单元，从而支持细胞增殖、抗逆性和神经传递。PHGDH表达升高和基因组扩增是黑色素瘤和乳腺癌的常见特征，丝氨酸通路活性增强已被认为是多种肿瘤代谢重编程的标志。在这些肿瘤中，PHGDH驱动的丝氨酸及其相关的一碳和氧化还原通路通量支持细胞在代谢压力下快速分裂和存活。 PHGDH 对苹果酸和 α-酮戊二酸的酶促混杂性使其处于糖酵解、丝氨酸合成和 TCA 循环代谢的界面，重组 PHGDH/苹果酸脱氢酶制剂在体外保留了这些多种活性，突显了 PHGDH 和苹果酸脱氢酶在更广泛的 2-羟基酸脱氢酶家族中的结构和机制上的亲缘关系。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:200 1:200
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 57 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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