Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody [K24A12] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody [K24A12] 仅识别 Ser65 处磷酸化的内源性 4E-BP1 蛋白水平。
背景	真核翻译起始因子4E结合蛋白1 (4E-BP1) 是翻译抑制因子家族的成员，也是雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信号通路中一个已明确下游效应蛋白。mTOR 作为细胞生长、增殖和存活的主要调控因子，响应细胞内外信号，例如营养物质、生长因子、激素和细胞因子。在该通路中，mTOR 复合物 1 (mTORC1) 磷酸化 S6 激酶 1 (S6K1) 和 4E-BP1 以促进蛋白质合成，而 mTOR 复合物 2 (mTORC2) 磷酸化 AKT 以增强细胞存活。 4E-BP1的主要功能是通过与真核翻译起始因子4E (eIF4E)结合来调节依赖于帽子的翻译起始。eIF4E是eIF4F复合物的限速组分，介导40S核糖体亚基募集到mRNA的5′端帽子结构。在低磷酸化状态下，4E-BP1隔离eIF4E并阻止其与eIF4G结合，从而阻断eIF4F复合物的组装并抑制翻译起始。磷酸化后，4E-BP1与eIF4E分离，从而形成eIF4F复合物并激活依赖于帽子的蛋白质合成。因此，磷酸化的4E-BP1被广泛认为是活跃mTOR信号转导的分子标记。 4E-BP1 中已鉴定出 7 个磷酸化位点：Thr37、Thr46、Ser65、Thr70、Ser83、Ser101 和 Ser112。体内多个残基以层级方式发生磷酸化。mTOR/FRAP 介导的 Thr37 和 Thr46 位点磷酸化不会破坏 eIF4E 结合，但会为 4E-BP1 在 Ser65 和 Thr70 位点的后续磷酸化做好准备，这对于 4E-BP1 从 eIF4E 中释放至关重要。此外，细胞外信号调节激酶 (ERK) 直接磷酸化 4E-BP1 的 Ser65 位点，并通过抑制 TSC2 间接促进 mTOR 活性，从而增强 4E-BP1 磷酸化和翻译起始。

特异性

Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody [K24A12] 仅识别 Ser65 处磷酸化的内源性 4E-BP1 蛋白水平。

背景

真核翻译起始因子4E结合蛋白1 (4E-BP1) 是翻译抑制因子家族的成员，也是雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信号通路中一个已明确下游效应蛋白。mTOR 作为细胞生长、增殖和存活的主要调控因子，响应细胞内外信号，例如营养物质、生长因子、激素和细胞因子。在该通路中，mTOR 复合物 1 (mTORC1) 磷酸化 S6 激酶 1 (S6K1) 和 4E-BP1 以促进蛋白质合成，而 mTOR 复合物 2 (mTORC2) 磷酸化 AKT 以增强细胞存活。 4E-BP1的主要功能是通过与真核翻译起始因子4E (eIF4E)结合来调节依赖于帽子的翻译起始。eIF4E是eIF4F复合物的限速组分，介导40S核糖体亚基募集到mRNA的5′端帽子结构。在低磷酸化状态下，4E-BP1隔离eIF4E并阻止其与eIF4G结合，从而阻断eIF4F复合物的组装并抑制翻译起始。磷酸化后，4E-BP1与eIF4E分离，从而形成eIF4F复合物并激活依赖于帽子的蛋白质合成。因此，磷酸化的4E-BP1被广泛认为是活跃mTOR信号转导的分子标记。 4E-BP1 中已鉴定出 7 个磷酸化位点：Thr37、Thr46、Ser65、Thr70、Ser83、Ser101 和 Ser112。体内多个残基以层级方式发生磷酸化。mTOR/FRAP 介导的 Thr37 和 Thr46 位点磷酸化不会破坏 eIF4E 结合，但会为 4E-BP1 在 Ser65 和 Thr70 位点的后续磷酸化做好准备，这对于 4E-BP1 从 eIF4E 中释放至关重要。此外，细胞外信号调节激酶 (ERK) 直接磷酸化 4E-BP1 的 Ser65 位点，并通过抑制 TSC2 间接促进 mTOR 活性，从而增强 4E-BP1 磷酸化和翻译起始。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

15-20 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Qin X, et al. Cell Cycle. 2016;15(6):781-6.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa (serum starved), Lane 2: HeLa (serum starved; insulin, 1 μM, 30 min), Lane 3: HeLa (serum starved; insulin, 1 μM, 30 min; λ phosphatase-treated)