Phospho-Akt1 (Ser129) Antibody [K23C4] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Akt1 (Ser129) Antibody [K23C4] 仅识别 Ser129 处磷酸化的内源性 Akt1 蛋白水平。
背景	磷酸化Akt1 (Ser129) 是Akt1（RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PKBα）的一种特异性翻译后修饰，发生在480个氨基酸组成的Akt1蛋白的pleckstrin同源(PH)结构域和激酶结构域之间的柔性连接区。Akt1包含一个N端PH结构域（用于PIP3介导的膜募集）、一个催化激酶结构域（其关键调控磷酸化位点位于Thr308（激活环）和Ser473（疏水基序））以及一个C端调控尾。蛋白激酶CK2对Ser129的磷酸化产生一个保守的SxxD/E基序，该基序启动后续Ser126的修饰，并稳定Akt1的整体构象。这种修饰通过增强Akt1与HSP90分子伴侣复合物的结合，使其活性超越经典PDK1/mTORC2磷酸化途径，从而保护Thr308免受PP2A介导的去磷酸化，维持Akt1的激酶活性。此外，磷酸化的Ser129通过直接作用或稳定Wnt信号通路组分，增强β-catenin/TCF的转录活性，并将Akt1锁定在延伸的活性构象中，使其能够进行亚型特异性的底物选择，例如优先磷酸化palladin。由于Akt2缺乏相应的Ser131位点，因此无法实现这一过程。这种修饰驱动细胞骨架重塑，通过抑制Bad和FoxO促进细胞存活，通过促进cyclin D1的稳定性和p27/p21的隔离促进细胞增殖，并通过TSC2磷酸化激活mTORC1。分级磷酸化确保在生长因子刺激下实现强大的信号放大。在疾病中，磷酸化Ser129水平升高会通过放大PI3K/Akt致癌信号（尤其是在乳腺癌和前列腺癌中）来增强癌细胞的存活和转移，通过持续的HSP90保护来促进化疗耐药性，并通过过度激活Akt1破坏葡萄糖稳态而与代谢紊乱有关。

特异性

Phospho-Akt1 (Ser129) Antibody [K23C4] 仅识别 Ser129 处磷酸化的内源性 Akt1 蛋白水平。

背景

磷酸化Akt1 (Ser129) 是Akt1（RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PKBα）的一种特异性翻译后修饰，发生在480个氨基酸组成的Akt1蛋白的pleckstrin同源(PH)结构域和激酶结构域之间的柔性连接区。Akt1包含一个N端PH结构域（用于PIP3介导的膜募集）、一个催化激酶结构域（其关键调控磷酸化位点位于Thr308（激活环）和Ser473（疏水基序））以及一个C端调控尾。蛋白激酶CK2对Ser129的磷酸化产生一个保守的SxxD/E基序，该基序启动后续Ser126的修饰，并稳定Akt1的整体构象。这种修饰通过增强Akt1与HSP90分子伴侣复合物的结合，使其活性超越经典PDK1/mTORC2磷酸化途径，从而保护Thr308免受PP2A介导的去磷酸化，维持Akt1的激酶活性。此外，磷酸化的Ser129通过直接作用或稳定Wnt信号通路组分，增强β-catenin/TCF的转录活性，并将Akt1锁定在延伸的活性构象中，使其能够进行亚型特异性的底物选择，例如优先磷酸化palladin。由于Akt2缺乏相应的Ser131位点，因此无法实现这一过程。这种修饰驱动细胞骨架重塑，通过抑制Bad和FoxO促进细胞存活，通过促进cyclin D1的稳定性和p27/p21的隔离促进细胞增殖，并通过TSC2磷酸化激活mTORC1。分级磷酸化确保在生长因子刺激下实现强大的信号放大。在疾病中，磷酸化Ser129水平升高会通过放大PI3K/Akt致癌信号（尤其是在乳腺癌和前列腺癌中）来增强癌细胞的存活和转移，通过持续的HSP90保护来促进化疗耐药性，并通过过度激活Akt1破坏葡萄糖稳态而与代谢紊乱有关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000 - 1:10000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

55 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: MCF-7, Lane 2: MCF-7 (Alkaline Phosphatase treated)