Phospho-AP2M1 (Thr156) Antibody [J20G9] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-AP2M1 (Thr156) Antibody [J20G9] 仅识别 Thr156 处磷酸化的内源性 AP2M1 蛋白水平。
背景	磷酸化AP2M1（Thr156）标记了AP-2网格蛋白衔接蛋白复合物μ2亚基（AP2M1）上的关键调控位点。AP-2是一种异源四聚体外壳蛋白，它将货物识别与质膜上的网格蛋白介导的内吞作用偶联起来。AP2M1位于AP-2弯曲“V”形结构的核心，其C端结构域形成货物结合界面，识别跨膜受体胞质尾部的典型YXXΦ及相关内吞分选基序；其N端区域参与构象转变，从而将货物结合与网格蛋白组装偶联起来。衔接蛋白相关激酶AAK1对AP2M1的Thr156位点进行磷酸化，诱导AP-2复合物发生构象变化，从而增加μ2货物结合位点对YXXΦ基序的可及性和亲和力，进而增强转铁蛋白受体等货物蛋白募集到正在组装的网格蛋白包被小窝，促进高效的受体介导内吞作用。这种磷酸化开关调控信号受体、离子通道和基质重塑酶的内化和转运，将AP2M1 Thr156磷酸化与生长因子、神经递质和整合素相关通路以及依赖于网格蛋白介导摄取的病毒入侵机制联系起来。 AP2M1 Thr156 磷酸化失调，无论是由 AAK1 还是帕金森氏症相关激酶 LRRK2 驱动，都会改变内吞能力和货物受体的运输，从而产生与神经退行性变和受体信号传导紊乱相关的内吞缺陷。

特异性

Phospho-AP2M1 (Thr156) Antibody [J20G9] 仅识别 Thr156 处磷酸化的内源性 AP2M1 蛋白水平。

背景

磷酸化AP2M1（Thr156）标记了AP-2网格蛋白衔接蛋白复合物μ2亚基（AP2M1）上的关键调控位点。AP-2是一种异源四聚体外壳蛋白，它将货物识别与质膜上的网格蛋白介导的内吞作用偶联起来。AP2M1位于AP-2弯曲“V”形结构的核心，其C端结构域形成货物结合界面，识别跨膜受体胞质尾部的典型YXXΦ及相关内吞分选基序；其N端区域参与构象转变，从而将货物结合与网格蛋白组装偶联起来。衔接蛋白相关激酶AAK1对AP2M1的Thr156位点进行磷酸化，诱导AP-2复合物发生构象变化，从而增加μ2货物结合位点对YXXΦ基序的可及性和亲和力，进而增强转铁蛋白受体等货物蛋白募集到正在组装的网格蛋白包被小窝，促进高效的受体介导内吞作用。这种磷酸化开关调控信号受体、离子通道和基质重塑酶的内化和转运，将AP2M1 Thr156磷酸化与生长因子、神经递质和整合素相关通路以及依赖于网格蛋白介导摄取的病毒入侵机制联系起来。 AP2M1 Thr156 磷酸化失调，无论是由 AAK1 还是帕金森氏症相关激酶 LRRK2 驱动，都会改变内吞能力和货物受体的运输，从而产生与神经退行性变和受体信号传导紊乱相关的内吞缺陷。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000-1:10000

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

49 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela (1% SDS Hot lysis), Lane 2: Hela (Calyculin A, 50 nM, 2 h; 1% SDS Hot lysis), Lane 3: Hela (Calyculin A, 50 nM, 2 h; 1% SDS Hot lysis; Alkaline Phosphatase, 1 h)