Phospho-BCKDHA (Ser293) Antibody (Rabbit mAb) [D4N17] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-BCKDHA (Ser293) Antibody (Rabbit mAb) [D4N17] 仅识别 Ser293 处磷酸化的内源性 BCKDHA 蛋白水平。
背景	磷酸化BCKDHA（Ser293）是指支链α-酮酸脱氢酶E1组分α亚基的调控性磷酸化状态。E1是一种线粒体酶，催化支链氨基酸（BCAA）分解代谢中的第一个限速氧化脱羧步骤，从而控制亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的系统水平。E1α亚基提供硫胺素焦磷酸依赖性脱羧酶活性位点，并含有两个可被磷酸化的丝氨酸残基。其中，位点1（大鼠中的Ser293以及小鼠和人类中的相应残基）是主要的调控位点，其修饰决定了复合物的活性。Ser293的磷酸化由BCKDH激酶（BCKDK）催化，BCKDK识别该丝氨酸周围的残基作为底物基序。 Ser293及其邻近的保守残基，例如Arg288、His292和Asp296，对于BCKDK的催化活性和底物识别至关重要。Ser293的替换会改变不同支链α-酮酸的Km值，但不影响Vmax，这凸显了该区域对酶促效率和激酶调控的双重作用。当BCKDK在Ser293位点磷酸化E1α时，BCKDH复合物失活，BCAA氧化降解的通量受到抑制，导致BCAA及其α-酮酸衍生物的滞留。特异性检测Ser293位点磷酸化的BCKDH-E1α的抗体已被用于证明，组织中高水平的磷酸化Ser293与低BCKDH活性相关。在肝脏中，BCKDH-E1α Ser293 磷酸化整合了营养和激素信号：2 型糖尿病和肥胖患者的肝脏 BCKDH 活性显著降低，且这种降低与 Ser293 磷酸化水平升高和血浆支链氨基酸 (BCAA) 浓度升高相关，表明磷酸化 E1α Ser293 与胰岛素抵抗和心血管代谢风险相关的 BCAA 特征相联系。通过抑制 BCKDK 或过表达特异性线粒体磷酸酶 PPM1K 来调控该通路，可以降低 E1α Ser293 磷酸化水平，重新激活 BCKDH，增强 BCAA 清除，并改善葡萄糖和脂质代谢，表明 Ser293 磷酸化状态在 BCAA 清除和下游代谢稳态中发挥着代谢调节器的作用。上游信号通路可以调节Ser293的磷酸化：例如，G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的激活会刺激JNK依赖的BCKDH-E1α在Ser293位点的磷酸化，而JNK的沉默则会消除这种GPER诱导的修饰，这表明激素信号和应激激酶可以通过Ser293位点参与BCKDH的调控。在心血管代谢疾病模型中，线粒体外BCKDH的失调以及BCAA代谢与能量产生的解偶联与BCKDH-E1α磷酸化的改变和能量代谢受损相关，这进一步强调了Ser293状态对于组织特异性BCAA处理和能量平衡的重要性。 E1α 的硫胺素依赖性脱羧酶结构，BCKDK 对 Ser293 的磷酸化和 PPM1K 对 Ser293 的去磷酸化的独特调节作用，以及磷酸化 BCKDH-E1α (Ser293) 与 BCAA 积累、糖尿病和心血管代谢功能障碍之间的已记录联系。

特异性

Phospho-BCKDHA (Ser293) Antibody (Rabbit mAb) [D4N17] 仅识别 Ser293 处磷酸化的内源性 BCKDHA 蛋白水平。

背景

磷酸化BCKDHA（Ser293）是指支链α-酮酸脱氢酶E1组分α亚基的调控性磷酸化状态。E1是一种线粒体酶，催化支链氨基酸（BCAA）分解代谢中的第一个限速氧化脱羧步骤，从而控制亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的系统水平。E1α亚基提供硫胺素焦磷酸依赖性脱羧酶活性位点，并含有两个可被磷酸化的丝氨酸残基。其中，位点1（大鼠中的Ser293以及小鼠和人类中的相应残基）是主要的调控位点，其修饰决定了复合物的活性。Ser293的磷酸化由BCKDH激酶（BCKDK）催化，BCKDK识别该丝氨酸周围的残基作为底物基序。 Ser293及其邻近的保守残基，例如Arg288、His292和Asp296，对于BCKDK的催化活性和底物识别至关重要。Ser293的替换会改变不同支链α-酮酸的Km值，但不影响Vmax，这凸显了该区域对酶促效率和激酶调控的双重作用。当BCKDK在Ser293位点磷酸化E1α时，BCKDH复合物失活，BCAA氧化降解的通量受到抑制，导致BCAA及其α-酮酸衍生物的滞留。特异性检测Ser293位点磷酸化的BCKDH-E1α的抗体已被用于证明，组织中高水平的磷酸化Ser293与低BCKDH活性相关。在肝脏中，BCKDH-E1α Ser293 磷酸化整合了营养和激素信号：2 型糖尿病和肥胖患者的肝脏 BCKDH 活性显著降低，且这种降低与 Ser293 磷酸化水平升高和血浆支链氨基酸 (BCAA) 浓度升高相关，表明磷酸化 E1α Ser293 与胰岛素抵抗和心血管代谢风险相关的 BCAA 特征相联系。通过抑制 BCKDK 或过表达特异性线粒体磷酸酶 PPM1K 来调控该通路，可以降低 E1α Ser293 磷酸化水平，重新激活 BCKDH，增强 BCAA 清除，并改善葡萄糖和脂质代谢，表明 Ser293 磷酸化状态在 BCAA 清除和下游代谢稳态中发挥着代谢调节器的作用。上游信号通路可以调节Ser293的磷酸化：例如，G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的激活会刺激JNK依赖的BCKDH-E1α在Ser293位点的磷酸化，而JNK的沉默则会消除这种GPER诱导的修饰，这表明激素信号和应激激酶可以通过Ser293位点参与BCKDH的调控。在心血管代谢疾病模型中，线粒体外BCKDH的失调以及BCAA代谢与能量产生的解偶联与BCKDH-E1α磷酸化的改变和能量代谢受损相关，这进一步强调了Ser293状态对于组织特异性BCAA处理和能量平衡的重要性。 E1α 的硫胺素依赖性脱羧酶结构，BCKDK 对 Ser293 的磷酸化和 PPM1K 对 Ser293 的去磷酸化的独特调节作用，以及磷酸化 BCKDH-E1α (Ser293) 与 BCAA 积累、糖尿病和心血管代谢功能障碍之间的已记录联系。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

50 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: COS-7, Lane 2: Vero