Phospho-β Catenin (Ser37) Antibody [H12E11] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-β Catenin (Ser37) Antibody [H12E11] 仅识别 Ser37 处磷酸化的内源性 β-catenin 总蛋白水平。
背景	p-β Catenin-Ser37（Ser37位点磷酸化 β 连环蛋白）是一种属于犰狳家族的多功能蛋白质，其特征是 12 个犰狳重复序列形成超螺旋结构，带有带正电荷的凹槽，可作为结合伙伴的多功能界面。它是一种 781 个氨基酸长的蛋白质，由 N 末端结构域 (NTD)、蛋白质中间的 12 个犰狳 (ARM) 结构域和 C 末端结构域 (CTD) 组成。它在钙粘蛋白介导的细胞间粘附和 Wnt 信号介导的转录调控中起双重作用。在粘附中，β-连环蛋白稳定膜上的钙粘蛋白并募集 α-连环蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架上，而在信号传导中，它在 Wnt 激活后充当 LEF/TCF 转录复合物的共激活因子。β-连环蛋白的功能受其磷酸化状态的严格调控； GSK3β 或 PKC 对 Ser37 位点（以及 S33 和 T41 位点）的磷酸化作用靶向 β-catenin，使其泛素化并被蛋白酶体降解，从而阻止异常的 Wnt 信号转导。配体磷酸化还可以通过增加与其犰狳结构域相互作用的负电荷来增强 β-catenin 的结合亲和力。其非结构化的 N 端和 C 端区域进一步调节相互作用的特异性和可及性。总而言之，β-catenin 的结构适应性和磷酸化依赖性调控对其在组织形态发生、细胞命运决定和组织完整性维持中的动态作用至关重要。

特异性

Phospho-β Catenin (Ser37) Antibody [H12E11] 仅识别 Ser37 处磷酸化的内源性 β-catenin 总蛋白水平。

背景

p-β Catenin-Ser37（Ser37位点磷酸化 β 连环蛋白）是一种属于犰狳家族的多功能蛋白质，其特征是 12 个犰狳重复序列形成超螺旋结构，带有带正电荷的凹槽，可作为结合伙伴的多功能界面。它是一种 781 个氨基酸长的蛋白质，由 N 末端结构域 (NTD)、蛋白质中间的 12 个犰狳 (ARM) 结构域和 C 末端结构域 (CTD) 组成。它在钙粘蛋白介导的细胞间粘附和 Wnt 信号介导的转录调控中起双重作用。在粘附中，β-连环蛋白稳定膜上的钙粘蛋白并募集 α-连环蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架上，而在信号传导中，它在 Wnt 激活后充当 LEF/TCF 转录复合物的共激活因子。β-连环蛋白的功能受其磷酸化状态的严格调控； GSK3β 或 PKC 对 Ser37 位点（以及 S33 和 T41 位点）的磷酸化作用靶向 β-catenin，使其泛素化并被蛋白酶体降解，从而阻止异常的 Wnt 信号转导。配体磷酸化还可以通过增加与其犰狳结构域相互作用的负电荷来增强 β-catenin 的结合亲和力。其非结构化的 N 端和 C 端区域进一步调节相互作用的特异性和可及性。总而言之，β-catenin 的结构适应性和磷酸化依赖性调控对其在组织形态发生、细胞命运决定和组织完整性维持中的动态作用至关重要。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

85 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HEK-293, Lane 2: HEK-293 (Calyculin A, 50nM, 3 h), Lane 3: HEK-293 (Calyculin A, 50nM, 3 h; alkaline phosphatase, 1 h)