Phospho-BRAF (Ser729) Antibody [H9E15] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-BRAF (Ser729) Antibody [H9E15] 仅识别 Ser729 处磷酸化的内源性 BRAF 蛋白水平。
背景	磷酸化BRAF（Ser729）属于RAF家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，该家族在MAPK/ERK级联反应中将RAS信号传递给MEK，从而驱动细胞增殖、分化和存活。BRAF由766个氨基酸组成，分为RAS结合域（150-224位氨基酸残基）、富含半胱氨酸的结构域（225-303位氨基酸残基）和激酶结构域（446-723位氨基酸残基）。C端Ser729位于激酶结构域之外，可与14-3-3结构域相互作用。在能量应激条件下，AMPK被激活，Ser729位点发生磷酸化，AMPKK直接靶向其最佳共有序列基序中的该残基。这种修饰增强了BRAF与14-3-3蛋白的结合，通过单个14-3-3二聚体连接BRAF亚基间的pSer729位点，从而隔离激酶并稳定其自身抑制状态。在自身抑制复合物中，14-3-3蛋白锁定C端尾部，防止过早二聚化，同时保持其组装能力以进行激活。RAS-GTP结合后，BRAF从这种抑制构象中释放出来，从而实现二聚化，αC螺旋发生位移，使调控脊柱排列以利于MEK磷酸化。因此，磷酸化的Ser729位点可在自身抑制的单体和活性二聚体之间切换BRAF，从而微调信号通路的输出；突变为Ala可增强KSR1的结合，提高MEK-ERK信号传导，并加速角质形成细胞的增殖。 AMPK介导的pSer729会破坏BRAF-KSR1支架，而该支架对于有效的信号传导至关重要，从而减弱AICAR诱导应激期间的ERK激活。黑色素瘤中的BRAF V600E突变绕过了这种调控，导致组成型激酶活性和治疗耐药性，而野生型pSer729则抑制病理性过度激活。活性二聚体中释放的14-3-3蛋白通过空间位阻调节MEK的亲和力，促进底物的顺序释放。

特异性

Phospho-BRAF (Ser729) Antibody [H9E15] 仅识别 Ser729 处磷酸化的内源性 BRAF 蛋白水平。

背景

磷酸化BRAF（Ser729）属于RAF家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，该家族在MAPK/ERK级联反应中将RAS信号传递给MEK，从而驱动细胞增殖、分化和存活。BRAF由766个氨基酸组成，分为RAS结合域（150-224位氨基酸残基）、富含半胱氨酸的结构域（225-303位氨基酸残基）和激酶结构域（446-723位氨基酸残基）。C端Ser729位于激酶结构域之外，可与14-3-3结构域相互作用。在能量应激条件下，AMPK被激活，Ser729位点发生磷酸化，AMPKK直接靶向其最佳共有序列基序中的该残基。这种修饰增强了BRAF与14-3-3蛋白的结合，通过单个14-3-3二聚体连接BRAF亚基间的pSer729位点，从而隔离激酶并稳定其自身抑制状态。在自身抑制复合物中，14-3-3蛋白锁定C端尾部，防止过早二聚化，同时保持其组装能力以进行激活。RAS-GTP结合后，BRAF从这种抑制构象中释放出来，从而实现二聚化，αC螺旋发生位移，使调控脊柱排列以利于MEK磷酸化。因此，磷酸化的Ser729位点可在自身抑制的单体和活性二聚体之间切换BRAF，从而微调信号通路的输出；突变为Ala可增强KSR1的结合，提高MEK-ERK信号传导，并加速角质形成细胞的增殖。 AMPK介导的pSer729会破坏BRAF-KSR1支架，而该支架对于有效的信号传导至关重要，从而减弱AICAR诱导应激期间的ERK激活。黑色素瘤中的BRAF V600E突变绕过了这种调控，导致组成型激酶活性和治疗耐药性，而野生型pSer729则抑制病理性过度激活。活性二聚体中释放的14-3-3蛋白通过空间位阻调节MEK的亲和力，促进底物的顺序释放。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000 - 1:10000

反应性

Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

84 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: PC-12, Lane 2: PC-12 (λ phosphatase-treated)