Phospho-CDC37 (Ser13) Antibody [G22K18] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-CDC37 (Ser13) Antibody [G22K18] 仅识别 Ser13 处磷酸化的内源性 CDC37 蛋白水平。
背景	热休克蛋白90 (Hsp90) 是一种重要的分子伴侣，调控着众多客户蛋白（尤其是信号分子和激酶）的折叠、成熟和稳定性。其活性受到协同伴侣网络的严格调控，这些协同伴侣网络负责协调客户蛋白的募集和构象转变。其中，细胞分裂周期蛋白37 (Cdc37，也称为p50) 是一种高度特化的协同伴侣，在蛋白激酶调控中发挥着重要作用。Cdc37作为激酶特异性衔接蛋白，能够募集多种激酶至Hsp90复合物，保护它们免于降解，并使其稳定化和功能成熟。由于大多数激酶依赖于Cdc37-Hsp90复合物进行正确的折叠和激活，因此这种募集被认为是不可或缺的。Cdc37由CDC37基因编码，在功能上与细胞增殖和存活相关。在酵母中，它通过稳定有丝分裂调控所必需的关键激酶复合物来维持细胞周期进程。在哺乳动物系统中，它调节热休克蛋白90 (Hsp90) 的ATP酶活性，从而影响对有效激酶加载至关重要的构象变化。CDC37表达的缺失或抑制会导致激酶信号传导缺陷、生长停滞和细胞凋亡。相反，Cdc37表达升高会促进细胞增殖，并与致癌过程相关，尤其是在前列腺癌中，Cdc37上调会导致增生和发育不良。因此，Cdc37作为Hsp90依赖性激酶调控的关键介质，将分子伴侣活性与细胞周期调控和肿瘤发生整合在一起。

特异性

Phospho-CDC37 (Ser13) Antibody [G22K18] 仅识别 Ser13 处磷酸化的内源性 CDC37 蛋白水平。

背景

热休克蛋白90 (Hsp90) 是一种重要的分子伴侣，调控着众多客户蛋白（尤其是信号分子和激酶）的折叠、成熟和稳定性。其活性受到协同伴侣网络的严格调控，这些协同伴侣网络负责协调客户蛋白的募集和构象转变。其中，细胞分裂周期蛋白37 (Cdc37，也称为p50) 是一种高度特化的协同伴侣，在蛋白激酶调控中发挥着重要作用。Cdc37作为激酶特异性衔接蛋白，能够募集多种激酶至Hsp90复合物，保护它们免于降解，并使其稳定化和功能成熟。由于大多数激酶依赖于Cdc37-Hsp90复合物进行正确的折叠和激活，因此这种募集被认为是不可或缺的。Cdc37由CDC37基因编码，在功能上与细胞增殖和存活相关。在酵母中，它通过稳定有丝分裂调控所必需的关键激酶复合物来维持细胞周期进程。在哺乳动物系统中，它调节热休克蛋白90 (Hsp90) 的ATP酶活性，从而影响对有效激酶加载至关重要的构象变化。CDC37表达的缺失或抑制会导致激酶信号传导缺陷、生长停滞和细胞凋亡。相反，Cdc37表达升高会促进细胞增殖，并与致癌过程相关，尤其是在前列腺癌中，Cdc37上调会导致增生和发育不良。因此，Cdc37作为Hsp90依赖性激酶调控的关键介质，将分子伴侣活性与细胞周期调控和肿瘤发生整合在一起。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

50 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293T, Lane 2: 3T3, Lane 3: C2C12, Lane 4: PC12