Phospho-Chk1 (Ser296) Antibody [F19D13]

目录号：F5055

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生物描述

特异性 Phospho-Chk1 (Ser296) Antibody [F19D13] 仅识别 Ser296 处磷酸化的内源性 Chk1 蛋白水平。
背景 磷酸化Chk1 (Ser296) 代表检查点激酶1 (Chk1) 的激活形式。Chk1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，对DNA损伤反应 (DDR) 至关重要，它整合ATR/ATM信号通路以执行细胞周期检查点、稳定复制叉并促进DNA修复或细胞凋亡。Chk1蛋白的N端包含一个激酶结构域，其中包含保守的催化三联体（激活环中的Lys38、Glu91和Asp147）；C端则包含一个调控性尾部，该尾部具有ATR磷酸化的SQ位点（Ser317和Ser345），以及位于非结构化环中的Ser296自磷酸化位点。 Ser296 的磷酸化是通过 ATR 依赖的顺式分子内自磷酸化机制发生的，且仅在 Ser317/Ser345 位点发生预磷酸化之后才会发生。预磷酸化解除了自身抑制，稳定了活性激酶构象，并使 Ser296 位点暴露出来以进行自身磷酸化。磷酸化的 Ser296 位点 Chk1 通过增强其对 Cdc25 磷酸酶（Cdc25A Ser76 介导 β-TrCP 介导的蛋白水解，Cdc25B/C Ser216/287 介导 14-3-3 蛋白的隔离）的激酶活性来增强检查点功能，从而防止 CDK1/2 过早激活并促进 S/G2/M 期细胞周期阻滞。它还能磷酸化其他效应蛋白，例如Treslin、Claspin和FanD2，以协调复制叉重启、同源重组和跨损伤合成；同时，中心体磷酸化Chk1抑制Cdc25B-CDK1，从而阻断有丝分裂的启动，直至DNA损伤修复。这种多位点激活级联反应确保了强大的DNA损伤反应（DDR）信号传导，而Ser296A突变体表现出检查点阻滞缺陷，并与ATR抑制剂产生合成致死性。磷酸化Chk1(Ser296)标志着复制压力，并预测对Chk1抑制剂的敏感性。Chk1抑制剂可消除复制叉保护，并在p53缺陷型肿瘤中诱导有丝分裂灾难；而Chk1过表达与卵巢癌、肺癌和血液系统恶性肿瘤的化疗耐药性相关。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 56 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (UV, 2 h), Lane 3: C6, Lane 4: C6 (UV, 2 h)