Phospho-cPLA2 (Ser505) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-cPLA2 (Ser505) Rabbit mAb 仅当 Ser505 位点磷酸化时才可检测内源性总 Phospho-cPLA2 (Ser505) 的蛋白水平。
背景	胞浆磷脂酶 A2 (Cytosolic Phospholipase A2, cPLA2) 是一种细胞间酶，属于 PLA2 酶家族的 IV 组，由六个亚基 (cPLA2α、cPLA2β、cPLA2γ、cPLA2δ、cPLA2ε 和 cPLA2ζ) 组成，分子量范围为 85 至 114 kDa。这些酶主要存在于血小板、巨噬细胞和肝脏、胰腺、脑和心脏等组织中。cPLA2 水解磷脂 sn-2 位的酯键，释放花生四烯酸和溶血磷脂，它们是炎症和其他生理过程的关键介质。cPLA2 的激活需要其转位到膜上，这得益于两个 Ca²⁺离子与其 CaLB 结构域的结合，从而将酶锚定到脂质双层上。酶的活性进一步受磷酸化调控，特别是在柔性连接区 Ser505 残基处。这种磷酸化主要由丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 介导，对于酶有效转位到富含磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2) 的膜至关重要。Ser505 突变会延迟膜转位，即使在 Ca²⁺ 和 PIP2 水平升高的情况下也是如此，这凸显了这种磷酸化事件在 cPLA2 激活中的重要性。

特异性

Phospho-cPLA2 (Ser505) Rabbit mAb 仅当 Ser505 位点磷酸化时才可检测内源性总 Phospho-cPLA2 (Ser505) 的蛋白水平。

背景

胞浆磷脂酶 A2 (Cytosolic Phospholipase A2, cPLA2) 是一种细胞间酶，属于 PLA2 酶家族的 IV 组，由六个亚基 (cPLA2α、cPLA2β、cPLA2γ、cPLA2δ、cPLA2ε 和 cPLA2ζ) 组成，分子量范围为 85 至 114 kDa。这些酶主要存在于血小板、巨噬细胞和肝脏、胰腺、脑和心脏等组织中。cPLA2 水解磷脂 sn-2 位的酯键，释放花生四烯酸和溶血磷脂，它们是炎症和其他生理过程的关键介质。cPLA2 的激活需要其转位到膜上，这得益于两个 Ca²⁺离子与其 CaLB 结构域的结合，从而将酶锚定到脂质双层上。酶的活性进一步受磷酸化调控，特别是在柔性连接区 Ser505 残基处。这种磷酸化主要由丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 介导，对于酶有效转位到富含磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2) 的膜至关重要。Ser505 突变会延迟膜转位，即使在 Ca²⁺ 和 PIP2 水平升高的情况下也是如此，这凸显了这种磷酸化事件在 cPLA2 激活中的重要性。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Rabbit

MW

95 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Khan SA, et al. Int J Mol Sci. 2023 Jan 10;24(2):1353.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa
Lane 2: HeLa (λ-phosphatase treated)
Lane 3: NIH/3T3
Lane 4: C2C12