Phospho-DDR1 (Tyr513) Antibody (Rabbit mAb) [F16D7] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-DDR1 (Tyr513) Antibody (Rabbit mAb) [F16D7] 仅识别 Tyr513 处磷酸化的内源性 DDR1 蛋白水平。
背景	磷酸化DDR1（Tyr513）代表盘状结构域受体1的激活状态。DDR1是DDR家族中的一种非经典受体酪氨酸激酶，其独特之处在于它能被细胞外基质胶原蛋白而非可溶性生长因子激活，这使其成为上皮细胞和间质细胞中组织硬度和基质组成的关键传感器。DDR1蛋白包含一个胞外盘状结构域，该结构域可结合多种胶原蛋白，包括I型、II型、III型、IV型、V型和VI型胶原蛋白；一个跨膜螺旋；以及一个胞内激酶结构域，该结构域包含一个激活环，Tyr513位于该激活环上，Tyr513是关键的自身磷酸化位点，与激酶活性和下游信号传导密切相关。胶原蛋白结合诱导DDR1聚集形成致密的膜聚集体，进而驱动Tyr513和其他酪氨酸残基的跨自身磷酸化，该过程独立于经典的激酶激活构象。这种聚集机制使得Tyr513磷酸化成为受体与纤维状胶原基质结合的直接指标。Tyr513的磷酸化为含有SH2结构域的蛋白（包括Src家族激酶、Shp-2磷酸酶以及Shc和Grb2等衔接蛋白）创建了对接位点，这些蛋白募集下游效应分子并启动PI3K、MAPK和Akt信号级联反应，从而调控细胞黏附、迁移、增殖和存活。 DDR1通过Tyr513磷酸化表位介导的信号通路上调基质金属蛋白酶的表达，驱动胶原重塑，并调节上皮-间质转化，从而在组织形态发生和修复过程中整合基质感知、蛋白水解活性和细胞骨架重组。DDR1 Tyr513磷酸化可被纳摩尔级效力的选择性小分子抑制剂抑制，例如DDR1-IN-5和DDR1-IN-6，这些抑制剂可抑制自身磷酸化并阻断下游致癌信号通路，因此该位点可作为癌症和纤维化疾病模型中DDR1激活的药理学靶点。包括乳腺癌、肺纤维化、肝纤维化和心血管疾病在内的病理状态，均涉及异常胶原沉积和基质重塑，这些疾病表现出DDR1 Tyr513磷酸化水平升高。这种修饰通过增强细胞-基质黏附、侵袭性迁移以及在肿瘤微环境和纤维化组织中持续的增殖信号传导，与疾病进展相关。DDR1在正常组织中表达局限于上皮细胞谱系，尤其是在肾脏、肺、胃肠道和脑组织中。DDR1表达失调会导致组织结构改变、乳腺发育过程中分支形态发生受损以及影响肿瘤免疫和慢性炎症的异常免疫反应。

特异性

Phospho-DDR1 (Tyr513) Antibody (Rabbit mAb) [F16D7] 仅识别 Tyr513 处磷酸化的内源性 DDR1 蛋白水平。

背景

磷酸化DDR1（Tyr513）代表盘状结构域受体1的激活状态。DDR1是DDR家族中的一种非经典受体酪氨酸激酶，其独特之处在于它能被细胞外基质胶原蛋白而非可溶性生长因子激活，这使其成为上皮细胞和间质细胞中组织硬度和基质组成的关键传感器。DDR1蛋白包含一个胞外盘状结构域，该结构域可结合多种胶原蛋白，包括I型、II型、III型、IV型、V型和VI型胶原蛋白；一个跨膜螺旋；以及一个胞内激酶结构域，该结构域包含一个激活环，Tyr513位于该激活环上，Tyr513是关键的自身磷酸化位点，与激酶活性和下游信号传导密切相关。胶原蛋白结合诱导DDR1聚集形成致密的膜聚集体，进而驱动Tyr513和其他酪氨酸残基的跨自身磷酸化，该过程独立于经典的激酶激活构象。这种聚集机制使得Tyr513磷酸化成为受体与纤维状胶原基质结合的直接指标。Tyr513的磷酸化为含有SH2结构域的蛋白（包括Src家族激酶、Shp-2磷酸酶以及Shc和Grb2等衔接蛋白）创建了对接位点，这些蛋白募集下游效应分子并启动PI3K、MAPK和Akt信号级联反应，从而调控细胞黏附、迁移、增殖和存活。 DDR1通过Tyr513磷酸化表位介导的信号通路上调基质金属蛋白酶的表达，驱动胶原重塑，并调节上皮-间质转化，从而在组织形态发生和修复过程中整合基质感知、蛋白水解活性和细胞骨架重组。DDR1 Tyr513磷酸化可被纳摩尔级效力的选择性小分子抑制剂抑制，例如DDR1-IN-5和DDR1-IN-6，这些抑制剂可抑制自身磷酸化并阻断下游致癌信号通路，因此该位点可作为癌症和纤维化疾病模型中DDR1激活的药理学靶点。包括乳腺癌、肺纤维化、肝纤维化和心血管疾病在内的病理状态，均涉及异常胶原沉积和基质重塑，这些疾病表现出DDR1 Tyr513磷酸化水平升高。这种修饰通过增强细胞-基质黏附、侵袭性迁移以及在肿瘤微环境和纤维化组织中持续的增殖信号传导，与疾病进展相关。DDR1在正常组织中表达局限于上皮细胞谱系，尤其是在肾脏、肺、胃肠道和脑组织中。DDR1表达失调会导致组织结构改变、乳腺发育过程中分支形态发生受损以及影响肿瘤免疫和慢性炎症的异常免疫反应。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

125 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: T47-D, Lane 2: T47-D (Collagen, 20 μg/ml, 18 h)