Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) Antibody (Rabbit mAb) [D20F17]

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生物描述

特异性 Phospho-Estrogen Receptor α (Ser167) Antibody (Rabbit mAb) [D20F17] 仅识别 Ser167 处磷酸化的内源性 Estrogen Receptor α 蛋白水平。
背景 磷酸化雌激素受体α (Ser167) 是雌激素受体α (ERα) 的一种配体和生长因子调控形式。ERα 是一种类固醇受体家族转录因子，它通过其模块化的DNA结合域、配体结合域和N端AF-1激活区整合雌激素信号与多种激酶级联反应。AF-1激活区包含Ser167，位于一组调控性丝氨酸簇内。AF-1结构域包含Ser104、Ser106、Ser118和Ser167，这些残基的磷酸化通过改变受体构象、染色质结合和共激活因子募集来调节ERα的转录输出。其中，Ser167是雌激素与mTOR/S6K1、MAPK/p90RSK、Akt和IKKε等激酶通路之间相互作用的关键节点。生长因子受体和致癌信号通路下游激活的激酶，包括S6K1、RSK、Akt和IKKε，可直接磷酸化Ser167，从而增强ERα依赖性转录活性，即使在配体浓度较低的情况下也能支持雌激素反应基因的表达，进而促进ERα阳性肿瘤细胞的细胞周期进程和增殖。Ser167磷酸化的位点特异性调控决定了ERα及其共激活因子复合物募集至雌激素反应启动子的时间模式，并影响控制细胞生长、存活、迁移和侵袭的靶基因谱。因此，Ser167不仅作为一种二元激活标记，而且还是与肿瘤行为和治疗反应相关的转录程序的决定因素。 Ser167 的磷酸化与上游 MAPK 和 S6K1 通路的激活以及磷酸化 ERα 在细胞核内的积累增加相关，这凸显了其作为促有丝分裂激酶活性下游信号通路以及生长因子和雌激素信号协同作用以维持 ERα 驱动转录的汇聚点的地位。对 ERα 阳性乳腺癌的临床分析表明，Ser167 位点磷酸化的 ERα 与内分泌治疗的疗效以及转移性乳腺癌复发后生存期的改善相关，这表明该修饰标志着即使在内分泌治疗存在的情况下，肿瘤仍保留着功能性 ER 信号传导能力。同时，持续的或激酶驱动的 Ser167 磷酸化促进了配体非依赖性的 ERα 激活以及对三苯氧胺和其他内分泌治疗的耐药机制，因为生长因子依赖性磷酸化即使在受体拮抗的情况下也能维持 ERα 靶基因的转录，并将磷酸化 Ser167 状态与激素依赖性恶性肿瘤（包括乳腺癌和子宫内膜癌）亚群的不良预后联系起来。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:1000 1:800
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 66 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: MCF7, Lane 2: MCF7 (hEGF, 100ng/ml, 15 min)