Phospho-FoxM1 (Thr600) Antibody (Rabbit mAb) [A10D13] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-FoxM1 (Thr600) Antibody (Rabbit mAb) [A10D13] 仅识别 Thr600 处磷酸化的内源性 FoxM1 蛋白水平。
背景	Thr600位点的磷酸化FoxM1代表有丝分裂相关的激活形式，即Forkhead box M1转录因子。Forkhead box M1是forkhead家族成员，控制着多种细胞周期基因的表达，这些基因对于DNA复制、G2/M期转换和有序的有丝分裂进程至关重要。FoxM1包含一个N端转录激活和调控区，该区域具有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点；一个位于细胞中央的forkhead DNA结合域，该域识别细胞周期基因启动子中的共有序列；以及一个C端转录激活域，该域募集共激活因子。在Thr600、Thr611和Thr620等位点，细胞周期蛋白/Cdk复合物的协同磷酸化，以及其他激酶的参与，使得FoxM1在S期晚期和G2/M期从非活性状态转变为具有转录活性的状态。 Thr600 位于转录激活区域的 Cdk 共识基序内，突变和相互作用分析表明，Thr600 和 Thr611 的磷酸化增强了 FoxM1 与细胞周期磷酸酶 CDC25A 的结合，稳定了这种相互作用，并促进了 CDC25A 依赖的抑制性 Cdk 残基的去磷酸化，从而形成了一个正反馈回路，其中 FoxM1 激活和 Thr600 磷酸化增强了 Cdk1/细胞周期蛋白 B 的激活，并驱动细胞进入有丝分裂。这种磷酸化状态受细胞周期调控，FoxM1蛋白水平在G1/S期开始升高，Thr600磷酸化的FoxM1在S/G2期晚期积累，此时正值FoxM1转位至细胞核以及CCNB1、PLK1、CDC25B、Aurora B和survivin等启动子转录活性达到峰值之前。这些启动子共同调控中心体成熟、纺锤体形成、染色体分离和胞质分裂。磷酸化特异性抗体和HTRF检测试剂盒仅识别Thr600位点磷酸化的FoxM1，这些工具表明Thr600磷酸化与有丝分裂起始紧密相关，并在增殖细胞和肿瘤细胞中升高。这些工具被广泛用作FoxM1通路激活的生物标志物，并用于筛选抑制Thr600磷酸化和下调FoxM1靶基因的小分子FoxM1抑制剂。对 FoxM1 在癌症中的生物学特性的研究表明，FOXM1 在许多人类肿瘤中过度表达和过度激活，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌，并通过在磷酸化 FoxM1 的控制下维持 G2/M 调节因子、DNA 修复因子和干性相关基因的表达，导致多种恶性肿瘤特征，如不受控制的增殖、基因组不稳定、上皮-间质转化、转移、治疗耐药性和逃避抗肿瘤免疫。 Thr600磷酸化的FoxM1水平高与侵袭性临床病理特征和不良预后相关，实验性FoxM1抑制剂可降低Thr600磷酸化并干扰FoxM1–CDC25A和FoxM1–PLK1回路，从而抑制肿瘤异种移植生长并降低FoxM1调控的有丝分裂基因的表达，这支持将磷酸化FoxM1 Thr600用作靶向药物作用的机制读数和候选治疗生物标志物。

特异性

Phospho-FoxM1 (Thr600) Antibody (Rabbit mAb) [A10D13] 仅识别 Thr600 处磷酸化的内源性 FoxM1 蛋白水平。

背景

Thr600位点的磷酸化FoxM1代表有丝分裂相关的激活形式，即Forkhead box M1转录因子。Forkhead box M1是forkhead家族成员，控制着多种细胞周期基因的表达，这些基因对于DNA复制、G2/M期转换和有序的有丝分裂进程至关重要。FoxM1包含一个N端转录激活和调控区，该区域具有多个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点；一个位于细胞中央的forkhead DNA结合域，该域识别细胞周期基因启动子中的共有序列；以及一个C端转录激活域，该域募集共激活因子。在Thr600、Thr611和Thr620等位点，细胞周期蛋白/Cdk复合物的协同磷酸化，以及其他激酶的参与，使得FoxM1在S期晚期和G2/M期从非活性状态转变为具有转录活性的状态。 Thr600 位于转录激活区域的 Cdk 共识基序内，突变和相互作用分析表明，Thr600 和 Thr611 的磷酸化增强了 FoxM1 与细胞周期磷酸酶 CDC25A 的结合，稳定了这种相互作用，并促进了 CDC25A 依赖的抑制性 Cdk 残基的去磷酸化，从而形成了一个正反馈回路，其中 FoxM1 激活和 Thr600 磷酸化增强了 Cdk1/细胞周期蛋白 B 的激活，并驱动细胞进入有丝分裂。这种磷酸化状态受细胞周期调控，FoxM1蛋白水平在G1/S期开始升高，Thr600磷酸化的FoxM1在S/G2期晚期积累，此时正值FoxM1转位至细胞核以及CCNB1、PLK1、CDC25B、Aurora B和survivin等启动子转录活性达到峰值之前。这些启动子共同调控中心体成熟、纺锤体形成、染色体分离和胞质分裂。磷酸化特异性抗体和HTRF检测试剂盒仅识别Thr600位点磷酸化的FoxM1，这些工具表明Thr600磷酸化与有丝分裂起始紧密相关，并在增殖细胞和肿瘤细胞中升高。这些工具被广泛用作FoxM1通路激活的生物标志物，并用于筛选抑制Thr600磷酸化和下调FoxM1靶基因的小分子FoxM1抑制剂。对 FoxM1 在癌症中的生物学特性的研究表明，FOXM1 在许多人类肿瘤中过度表达和过度激活，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌，并通过在磷酸化 FoxM1 的控制下维持 G2/M 调节因子、DNA 修复因子和干性相关基因的表达，导致多种恶性肿瘤特征，如不受控制的增殖、基因组不稳定、上皮-间质转化、转移、治疗耐药性和逃避抗肿瘤免疫。 Thr600磷酸化的FoxM1水平高与侵袭性临床病理特征和不良预后相关，实验性FoxM1抑制剂可降低Thr600磷酸化并干扰FoxM1–CDC25A和FoxM1–PLK1回路，从而抑制肿瘤异种移植生长并降低FoxM1调控的有丝分裂基因的表达，这支持将磷酸化FoxM1 Thr600用作靶向药物作用的机制读数和候选治疗生物标志物。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

84 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (Nocodazole, 100 ng/ml, 24 h)