Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) Antibody [G2K20]

目录号：F0854

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生物描述

特异性 Phospho-IRAK4 (Thr345/Ser346) Antibody [G2K20] 仅识别 Thr345/Ser346 处磷酸化的内源性 IRAK4 蛋白水平。
背景 磷酸化IRAK4 (Thr345/Ser346) 是丝氨酸/苏氨酸激酶IRAK4的活化形式，IRAK4是先天免疫信号传导的关键介质，其信号传导通过IL-1R和Toll样受体(TLR)发挥作用。IRAK4包含一个N端死亡结构域，用于与MyD88结合，以及一个C端激酶结构域，该结构域包含必需的激活环残基（Thr342、Thr345、Ser346和Thr352）。受体刺激后，MyD88募集IRAK4，触发其二聚化和分子间自磷酸化，主要发生在Thr345/Ser346位点，这是激酶完全激活所必需的。Thr342、Thr345或Ser346中任意两个残基的磷酸化均足以激活IRAK4。这种磷酸化发生在IL-1或TLR激动剂刺激后15-30分钟，并可被IRAK4抑制剂阻断。磷酸化使IRAK4能够磷酸化下游靶点，如Pellino1和IRAK1，进而导致Myddosome的形成以及TAK1、IKK（NF-κB通路）和MAPK（JNK、p38、ERK）的激活，最终导致细胞因子（例如IL-6、TNF-α）的产生。磷酸化IRAK4的功能影响具有细胞类型特异性：在原代人单核细胞中，激酶抑制会降低细胞因子的产生；而在真皮成纤维细胞中，IRAK4的支架功能足以进行信号传导，尽管在IRAK4缺陷细胞中这两种功能均丧失。IRAK4活性失调与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关，激酶失活突变体在关节炎等模型中具有保护作用。虽然 IRAK4 具有一定的基础活性，但在免疫激活后会高度磷酸化。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000 1:50
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 55 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

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