Phospho-JAK2 (Tyr1007) Antibody (Rabbit mAb) [G9F22] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-JAK2 (Tyr1007) Antibody (Rabbit mAb) [G9F22] 仅识别 Tyr1007 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平。
背景	磷酸化JAK2 (Tyr1007) 代表非受体酪氨酸激酶JAK2的活化形式，JAK2是Janus激酶家族的成员，是许多I类和II类细胞因子受体的主要催化信号模块，包括促红细胞生成素、促血小板生成素、生长激素、白细胞介素和干扰素受体。该蛋白包含一个N端FERM结构域，该结构域介导其与细胞因子受体近端胞质区的组成性结合；其后依次为SH2样结构域、自调节假激酶结构域(JH2)和C端酪氨酸激酶结构域(JH1)，后者包含含有Tyr1007及其相邻Tyr1008的激活环。细胞因子与预结合受体二聚体的胞外结构域结合，诱导构象重排，使两个受体结合的JAK2分子并置，从而允许激活环内Tyr1007发生反式自磷酸化；该位点的磷酸化是完全催化活性所必需的，并稳定激酶结构域的活性构象，使其能够有效地磷酸化受体胞质尾部和下游底物。磷酸化的激活环促进底物接近并提高催化周转率，同样的构象变化也解除了假激酶结构域施加的抑制性限制（该结构域通常会抑制JAK2活性），因此Tyr1007的磷酸化成为从潜在的受体结合状态转变为活性信号激酶状态的关键开关。活化的磷酸化JAK2（Tyr1007）可磷酸化相关细胞因子受体上的酪氨酸残基，从而为含有SH2结构域的信号蛋白（最主要的是STAT转录因子）创造结合位点。STAT转录因子识别特定的受体磷酸酪氨酸残基后，自身关键酪氨酸残基会被JAK2磷酸化，随后二聚化并转位至细胞核，驱动调控细胞增殖、分化、存活和免疫效应功能的转录程序。其他能与磷酸化受体-JAK2复合物结合的底物包括衔接蛋白（如Shc）、胰岛素受体底物和黏着斑激酶。这些底物将磷酸化JAK2的输出信号偶联至Ras-MAPK、PI3K-Akt和黏附相关通路，从而将Tyr1007依赖性激活的影响范围从经典的JAK-STAT轴扩展到更广泛的促有丝分裂和迁移信号网络。 Tyr1007 的磷酸化状态受到上游细胞因子输入、激酶自身磷酸化和蛋白酪氨酸磷酸酶之间平衡的严格调控。相关 JAK 家族成员和 Tyk2 中同源的激活环酪氨酸具有类似的功能，这凸显了激活环磷酸化在控制 Janus 激酶活性方面的保守性需求。JAK2 在 Tyr1007 位点或其上游的激活失调，包括假激酶结构域的突变（这些突变会削弱其抑制作用并允许组成型激活环磷酸化），与骨髓增生性肿瘤和以 JAK-STAT 信号过度激活为特征的炎症性疾病相关。

特异性

Phospho-JAK2 (Tyr1007) Antibody (Rabbit mAb) [G9F22] 仅识别 Tyr1007 处磷酸化的内源性 JAK2 蛋白水平。

背景

磷酸化JAK2 (Tyr1007) 代表非受体酪氨酸激酶JAK2的活化形式，JAK2是Janus激酶家族的成员，是许多I类和II类细胞因子受体的主要催化信号模块，包括促红细胞生成素、促血小板生成素、生长激素、白细胞介素和干扰素受体。该蛋白包含一个N端FERM结构域，该结构域介导其与细胞因子受体近端胞质区的组成性结合；其后依次为SH2样结构域、自调节假激酶结构域(JH2)和C端酪氨酸激酶结构域(JH1)，后者包含含有Tyr1007及其相邻Tyr1008的激活环。细胞因子与预结合受体二聚体的胞外结构域结合，诱导构象重排，使两个受体结合的JAK2分子并置，从而允许激活环内Tyr1007发生反式自磷酸化；该位点的磷酸化是完全催化活性所必需的，并稳定激酶结构域的活性构象，使其能够有效地磷酸化受体胞质尾部和下游底物。磷酸化的激活环促进底物接近并提高催化周转率，同样的构象变化也解除了假激酶结构域施加的抑制性限制（该结构域通常会抑制JAK2活性），因此Tyr1007的磷酸化成为从潜在的受体结合状态转变为活性信号激酶状态的关键开关。活化的磷酸化JAK2（Tyr1007）可磷酸化相关细胞因子受体上的酪氨酸残基，从而为含有SH2结构域的信号蛋白（最主要的是STAT转录因子）创造结合位点。STAT转录因子识别特定的受体磷酸酪氨酸残基后，自身关键酪氨酸残基会被JAK2磷酸化，随后二聚化并转位至细胞核，驱动调控细胞增殖、分化、存活和免疫效应功能的转录程序。其他能与磷酸化受体-JAK2复合物结合的底物包括衔接蛋白（如Shc）、胰岛素受体底物和黏着斑激酶。这些底物将磷酸化JAK2的输出信号偶联至Ras-MAPK、PI3K-Akt和黏附相关通路，从而将Tyr1007依赖性激活的影响范围从经典的JAK-STAT轴扩展到更广泛的促有丝分裂和迁移信号网络。 Tyr1007 的磷酸化状态受到上游细胞因子输入、激酶自身磷酸化和蛋白酪氨酸磷酸酶之间平衡的严格调控。相关 JAK 家族成员和 Tyk2 中同源的激活环酪氨酸具有类似的功能，这凸显了激活环磷酸化在控制 Janus 激酶活性方面的保守性需求。JAK2 在 Tyr1007 位点或其上游的激活失调，包括假激酶结构域的突变（这些突变会削弱其抑制作用并允许组成型激活环磷酸化），与骨髓增生性肿瘤和以 JAK-STAT 信号过度激活为特征的炎症性疾病相关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

130 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 3T3, Lane 2: 3T3 (Pervanadate, 1 mM, 10 min)