Phospho-MLKL (Ser345) Antibody [G22F14] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-MLKL (Ser345) Antibody [G22F14] 仅识别 Ser345 处磷酸化的内源性 MLKL 蛋白水平。
背景	磷酸化MLKL（Ser345）是混合谱系激酶结构域样蛋白家族中的一种假激酶，是坏死性凋亡的核心效应分子。坏死性凋亡是一种受调控的细胞死亡形式，当caspase活性被抑制时，TNF家族细胞因子、Toll样受体和病毒传感器会激活该过程。小鼠MLKL是一种由464个氨基酸组成的蛋白质，其N端包含一个四螺旋束（4HB；氨基酸残基1-140）、一个柔性连接区和一个C端假激酶结构域（PSKD；氨基酸残基175-425）。由于非典型的Asp381残基，PSKD缺乏催化活性。关键的Ser345残基位于PSKD的激活环中。坏死体组装由RIPK1/RIPK3通过RHIM结构域的相互作用介导，使RIPK3能够磷酸化MLKL的Ser345位点。这种磷酸化诱导构象变化，破坏Lys219-Gln343相互作用，使4HB暴露出来，从而形成同源三聚体。磷酸化的MLKL三聚体随后从胞质溶胶转位至质膜，通过4HB上的碱性口袋结合磷脂酰肌醇磷酸酯（如PI(4,5)P2和InsP6），形成膜孔，导致钙离子内流和细胞渗透性裂解。病毒感染期间，核内ZBP1募集RIPK3磷酸化MLKL的Ser345位点，导致核膜破裂和DNA泄漏，进而激活胞质抗病毒反应。卷曲螺旋结构域2（CC2；残基120-140）促进MLKL寡聚化，而PGAM5将坏死体锚定到线粒体上，以确保其高效执行。 Ser345 磷酸化是不可或缺的，该位点的突变会消除坏死性凋亡，但不会消除细胞凋亡，因此磷酸化 MLKL 可作为坏死性凋亡的生物标志物，可通过免疫组织化学在组织中检测到，尤其是在 Casp8/FADD 缺陷模型中，该模型显示角质形成细胞或肠道坏死性凋亡。

特异性

Phospho-MLKL (Ser345) Antibody [G22F14] 仅识别 Ser345 处磷酸化的内源性 MLKL 蛋白水平。

背景

磷酸化MLKL（Ser345）是混合谱系激酶结构域样蛋白家族中的一种假激酶，是坏死性凋亡的核心效应分子。坏死性凋亡是一种受调控的细胞死亡形式，当caspase活性被抑制时，TNF家族细胞因子、Toll样受体和病毒传感器会激活该过程。小鼠MLKL是一种由464个氨基酸组成的蛋白质，其N端包含一个四螺旋束（4HB；氨基酸残基1-140）、一个柔性连接区和一个C端假激酶结构域（PSKD；氨基酸残基175-425）。由于非典型的Asp381残基，PSKD缺乏催化活性。关键的Ser345残基位于PSKD的激活环中。坏死体组装由RIPK1/RIPK3通过RHIM结构域的相互作用介导，使RIPK3能够磷酸化MLKL的Ser345位点。这种磷酸化诱导构象变化，破坏Lys219-Gln343相互作用，使4HB暴露出来，从而形成同源三聚体。磷酸化的MLKL三聚体随后从胞质溶胶转位至质膜，通过4HB上的碱性口袋结合磷脂酰肌醇磷酸酯（如PI(4,5)P2和InsP6），形成膜孔，导致钙离子内流和细胞渗透性裂解。病毒感染期间，核内ZBP1募集RIPK3磷酸化MLKL的Ser345位点，导致核膜破裂和DNA泄漏，进而激活胞质抗病毒反应。卷曲螺旋结构域2（CC2；残基120-140）促进MLKL寡聚化，而PGAM5将坏死体锚定到线粒体上，以确保其高效执行。 Ser345 磷酸化是不可或缺的，该位点的突变会消除坏死性凋亡，但不会消除细胞凋亡，因此磷酸化 MLKL 可作为坏死性凋亡的生物标志物，可通过免疫组织化学在组织中检测到，尤其是在 Casp8/FADD 缺陷模型中，该模型显示角质形成细胞或肠道坏死性凋亡。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:150

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

54 kDa, 57 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: L-929, Lane 2: L-929 (TNFα, 20 ng/ml; BV6, 100 nM; z-VAD, 20 µM, 8 h)