Phospho-MLKL (Ser358) Antibody (Rabbit mAb) [K9E15] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-MLKL (Ser358) Antibody (Rabbit mAb) [K9E15] 仅识别 Ser358 处磷酸化的内源性 MLKL 蛋白水平。
背景	磷酸化MLKL（Ser358）是坏死性凋亡通路中混合谱系激酶结构域样假激酶的激活执行形式。MLKL位于RIPK3下游，将受体近端坏死体信号转化为终末膜破坏和裂解性细胞死亡。全长蛋白包含一个N端四螺旋束执行结构域、一个中央支撑区和一个C端假激酶结构域，该假激酶结构域的激活环包含Thr357和Ser358；该假激酶片段不催化磷酸转移，而是作为调节开关，感知RIPK3的磷酸化，并通过变构作用释放N端螺旋束以结合细胞膜。由死亡受体、模式识别受体或其他上游信号启动的坏死性凋亡信号最终汇聚于RIPK3的激活和RIPK1-RIPK3-MLKL复合物的组装。在复合物中，RIPK3磷酸化MLKL激活环上的Thr357和Ser358位点，生成磷酸化MLKL（Ser358），该磷酸化与坏死性凋亡的启动密切相关。这些残基的磷酸化驱动假激酶结构域发生构象转变，促进MLKL从RIPK3上解离，暴露N端四螺旋束，并形成从胞质溶胶转位至质膜的MLKL高阶寡聚体。寡聚化的磷酸化MLKL将其N端螺旋插入质膜内层，并与特定的磷脂结合，从而扰乱膜的结构和完整性，形成破坏性聚集体，导致离子失衡、细胞肿胀，最终导致膜破裂，这是坏死性细胞死亡的特征。结构和生化分析表明，激活环的磷酸化足以激活MLKL的杀伤活性，而磷酸化模拟的激活环突变体则绕过上游信号诱导非刺激依赖性坏死，这凸显了Thr357/Ser358区域的核心调控地位，并支持将Ser358磷酸化作为MLKL激活状态的精确分子标记。 MLKL激活环之外的翻译后修饰，包括假激酶结构域内的额外磷酸化事件，进一步调节寡聚化效率、膜结合和亚细胞定位，使得Ser358磷酸化成为更广泛的修饰密码的一部分，该密码控制着感染和炎症环境下MLKL依赖性坏死性凋亡的强度和背景。磷酸化MLKL（Ser358）主要定位于质膜，在某些情况下，在坏死性凋亡后期也定位于细胞内膜，这使其与非磷酸化MLKL区分开来，并提供了一种执行阶段坏死性凋亡信号的空间和生化读数，广泛用于绘制组织和疾病模型中的坏死性凋亡活性。在病理生理条件下，包括缺血性损伤、炎症性疾病和某些癌症，磷酸化 MLKL (Ser358) 的积累伴随着 RIPK3 的激活和坏死性细胞丢失，将这种修饰与组织损伤、炎症细胞因子释放和肿瘤微环境的调节联系起来，而 RIPK3-MLKL 轴的基因或药理学抑制会减少磷酸化 MLKL 的形成和坏死性细胞凋亡的输出。

特异性

Phospho-MLKL (Ser358) Antibody (Rabbit mAb) [K9E15] 仅识别 Ser358 处磷酸化的内源性 MLKL 蛋白水平。

背景

磷酸化MLKL（Ser358）是坏死性凋亡通路中混合谱系激酶结构域样假激酶的激活执行形式。MLKL位于RIPK3下游，将受体近端坏死体信号转化为终末膜破坏和裂解性细胞死亡。全长蛋白包含一个N端四螺旋束执行结构域、一个中央支撑区和一个C端假激酶结构域，该假激酶结构域的激活环包含Thr357和Ser358；该假激酶片段不催化磷酸转移，而是作为调节开关，感知RIPK3的磷酸化，并通过变构作用释放N端螺旋束以结合细胞膜。由死亡受体、模式识别受体或其他上游信号启动的坏死性凋亡信号最终汇聚于RIPK3的激活和RIPK1-RIPK3-MLKL复合物的组装。在复合物中，RIPK3磷酸化MLKL激活环上的Thr357和Ser358位点，生成磷酸化MLKL（Ser358），该磷酸化与坏死性凋亡的启动密切相关。这些残基的磷酸化驱动假激酶结构域发生构象转变，促进MLKL从RIPK3上解离，暴露N端四螺旋束，并形成从胞质溶胶转位至质膜的MLKL高阶寡聚体。寡聚化的磷酸化MLKL将其N端螺旋插入质膜内层，并与特定的磷脂结合，从而扰乱膜的结构和完整性，形成破坏性聚集体，导致离子失衡、细胞肿胀，最终导致膜破裂，这是坏死性细胞死亡的特征。结构和生化分析表明，激活环的磷酸化足以激活MLKL的杀伤活性，而磷酸化模拟的激活环突变体则绕过上游信号诱导非刺激依赖性坏死，这凸显了Thr357/Ser358区域的核心调控地位，并支持将Ser358磷酸化作为MLKL激活状态的精确分子标记。 MLKL激活环之外的翻译后修饰，包括假激酶结构域内的额外磷酸化事件，进一步调节寡聚化效率、膜结合和亚细胞定位，使得Ser358磷酸化成为更广泛的修饰密码的一部分，该密码控制着感染和炎症环境下MLKL依赖性坏死性凋亡的强度和背景。磷酸化MLKL（Ser358）主要定位于质膜，在某些情况下，在坏死性凋亡后期也定位于细胞内膜，这使其与非磷酸化MLKL区分开来，并提供了一种执行阶段坏死性凋亡信号的空间和生化读数，广泛用于绘制组织和疾病模型中的坏死性凋亡活性。在病理生理条件下，包括缺血性损伤、炎症性疾病和某些癌症，磷酸化 MLKL (Ser358) 的积累伴随着 RIPK3 的激活和坏死性细胞丢失，将这种修饰与组织损伤、炎症细胞因子释放和肿瘤微环境的调节联系起来，而 RIPK3-MLKL 轴的基因或药理学抑制会减少磷酸化 MLKL 的形成和坏死性细胞凋亡的输出。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

54 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (TNFα, 20ng/ml; Calyculin A, 100nM, 0.5 h)