Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody [G3C12]

目录号：F3969

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生物描述

特异性 Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody [G3C12] 仅识别 Ser2481 处磷酸化的内源性 mTOR 蛋白水平。
背景 磷酸化mTOR Ser2481标志着mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）C端调控结构域内Ser2481的自身磷酸化。mTOR是一种由2549个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于PIKK家族，可组装成两种不同的多蛋白复合物：雷帕霉素敏感的mTORC1（mTOR-Raptor-mLST8-PRAS40-DEPTOR）负责感知营养物质、氨基酸和能量；以及雷帕霉素不敏感或耐药的mTORC2（mTOR-Rictor-mSin1-mLST8-DEPTOR-Protor），后者作为细胞生长、代谢和存活的主控因子。Ser2481位于最近进化出的脊椎动物特有的C端疏水基序或激活环区域（2430-2450 aa）中，该区域与激酶自身抑制的解除有关。完整的 mTORC2 是 pSer2481 的必要条件，Rictor 或 mSin1 敲低或 Sin1-/- MEF 细胞均可消除 pSer2481，这使其区别于 mTORC1 特异性的 pSer2448 Akt、S6K1 和雷帕霉素敏感型。pSer2481 可作为完整、具有催化活性的 mTORC2 的生物标志物：它表明 mTORC2 已完成功能性组装，从而能够激活其标志性功能，包括 Akt Ser473 磷酸化、疏水基序启动、PKCα 激活和肌动蛋白细胞骨架组织，而这些功能独立于 mTORC1 的效应，例如 S6K1 T389 或 4E-BP1 Thr37/46 的翻译调控。pSer2481 监测 mTORC2 介导的合成代谢、脂质和蛋白质合成、细胞运动和增殖以及应激反应的时空调控。雷帕霉素及其类似物可抑制雷帕霉素敏感癌细胞系中的pSer2481，从而预测mTORC2的解离并揭示其与环境相关的脆弱性。pSer2481水平升高与肝细胞癌（HCC）和乳腺癌等肿瘤中mTORC2的活性相关，通过Akt和PKC的过度激活驱动肿瘤发生，并可作为雷帕霉素类似物疗效的药效学指标，优于间接的Akt pS473（因为PI3K的干扰）。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:500 - 1:5000 1:20 - 1:200
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 288 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：250 mA, 180 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:500），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: A549, Lane 2: A549 (EGF treated)