Phospho-p130 (Ser672) Antibody [E21C6]

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生物描述

特异性 Phospho-p130 (Ser672) Antibody [E21C6] 仅识别 Ser672 处磷酸化的内源性 p130 蛋白水平。
背景 磷酸化p130（Ser672）指的是视网膜母细胞瘤相关蛋白p130（RBL2），它是口袋蛋白家族（包括pRb和p107）中的关键肿瘤抑制因子，通过结合并抑制E2F转录因子来维持G0/G1期细胞周期阻滞。p130包含保守的N端、间隔区和C端区域，具有一个大的A/B口袋结构域（细胞周期蛋白结合基序）和多个细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）靶向的磷酸化位点。其中，C端的Ser672是CDK4/6特异性磷酸化位点，对蛋白酶体降解至关重要。在G1/S期后期，CDK4/6对Ser672的磷酸化使p130被F-box蛋白Skp2识别，Skp2是SCF^Skp2泛素连接酶复合物的组成部分。这使得p130能够发生多聚泛素化和快速的蛋白酶体降解，且该过程独立于CDK2活性。因此，p130介导的E2F反应基因的抑制作用得以解除，从而允许细胞进入S期、进行DNA复制和增殖，同时终止p130的生长抑制功能。在静止的G0期细胞中，低磷酸化的p130与E2F4/5-DP1形成稳定的复合物，从而沉默增殖相关基因；随着细胞重新进入细胞周期，Ser672位点的磷酸化动态地降低p130的水平。CDK4/6-Skp2-p130轴的失调或p130突变可稳定高磷酸化形式的p130，并破坏细胞周期检查点，从而促进不受控制的增殖和癌症的发生发展。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:5000 - 1:10000 1:20
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 128 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data