Phospho-PDGF Receptor β (Tyr 771) Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-PDGF Receptor β (Tyr 771) Rabbit mAb 用于检测当Tyr 771 位点磷酸化时内源性 Phospho-PDGF Receptor β 总的蛋白水平。
背景	血小板衍生生长因子 (PDGF) 家族由几种通过二硫键连接的二聚体亚型组成，包括 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC 和 PDGF-DD。这些亚型对两种密切相关的受体酪氨酸激酶表现出特异性结合亲和力：PDGF 受体 α (PDGFRα) 和 PDGF 受体 β (PDGFRβ)。PDGFRα 同型二聚体与除含有 PDGF-D 的 PDGF 亚型之外的所有 PDGF 亚型相互作用，而 PDGFRβ 同型二聚体与 PDGF-BB、PDGF-DD 和 PDGF-AB 异二聚体结合。异二聚体受体 α/β 识别 PDGF-B、PDGF-C 和 PDGF-D 同型二聚体以及 PDGF-AB 异二聚体。配体结合触发受体二聚化和自磷酸化，从而能够募集和激活具有 SH2 结构域的细胞质信号蛋白，例如 GRB2、Src、GAP、PI3K、PLCγ 和 NCK。这些激活的受体启动信号通路，调控基本细胞功能，包括增殖、细胞骨架重组、迁移和分化。PDGF β 受体上的酪氨酸 771 可作为 Ras GTPase 活化蛋白 (RasGAP) 的对接位点。SHP-2 已被证明在调控酪氨酸 771 的磷酸化方面发挥关键作用，从而影响 RasGAP 募集并调控由 PDGF 受体介导的 Ras/MAPK 信号通路。

特异性

Phospho-PDGF Receptor β (Tyr 771) Rabbit mAb 用于检测当Tyr 771 位点磷酸化时内源性 Phospho-PDGF Receptor β 总的蛋白水平。

背景

血小板衍生生长因子 (PDGF) 家族由几种通过二硫键连接的二聚体亚型组成，包括 PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC 和 PDGF-DD。这些亚型对两种密切相关的受体酪氨酸激酶表现出特异性结合亲和力：PDGF 受体 α (PDGFRα) 和 PDGF 受体 β (PDGFRβ)。PDGFRα 同型二聚体与除含有 PDGF-D 的 PDGF 亚型之外的所有 PDGF 亚型相互作用，而 PDGFRβ 同型二聚体与 PDGF-BB、PDGF-DD 和 PDGF-AB 异二聚体结合。异二聚体受体 α/β 识别 PDGF-B、PDGF-C 和 PDGF-D 同型二聚体以及 PDGF-AB 异二聚体。配体结合触发受体二聚化和自磷酸化，从而能够募集和激活具有 SH2 结构域的细胞质信号蛋白，例如 GRB2、Src、GAP、PI3K、PLCγ 和 NCK。这些激活的受体启动信号通路，调控基本细胞功能，包括增殖、细胞骨架重组、迁移和分化。PDGF β 受体上的酪氨酸 771 可作为 Ras GTPase 活化蛋白 (RasGAP) 的对接位点。SHP-2 已被证明在调控酪氨酸 771 的磷酸化方面发挥关键作用，从而影响 RasGAP 募集并调控由 PDGF 受体介导的 Ras/MAPK 信号通路。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit

MW

190 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 将细胞转移至EP管中。用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声破碎，冰上静置裂解 30 min。冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: NIH/3T3
Lane 2: NIH/3T3 (PDGF-BB-treated)