Phospho-Phospholipase Cγ1/PLC-γ-1 (Tyr783) Antibody [J4J15]

目录号：F3884

打印

生物描述

特异性 Phospho-Phospholipase Cγ1/PLC-γ-1 (Tyr783) Antibody [J4J15] 仅识别 Tyr783 处磷酸化的内源性 Phospholipase Cγ1/PLC-γ-1 蛋白水平。
背景 磷脂酶Cγ1 (Tyr783) 是PLC-γ1的活化形式，也是受体酪氨酸激酶 (RTK) 信号通路中的关键效应分子。RTK激活后，PLC-γ1的Tyr783位点发生磷酸化，通常由EGFR、PDGFR、Syk或Src家族成员等激酶介导。这种磷酸化事件触发构象变化，解除分离的SH2-SH2-SH3结构域对催化核心的自身抑制作用。磷酸化的Tyr783位于SH2连接区，与cSH2结构域发生分子内结合，使其脱离C2核心界面，从而暴露活性位点，使其能够与膜对接并进行催化。 PLC-γ1 具有 N 端 PH 结构域，用于募集 PIP2 至细胞膜；催化 TIM 桶状结构域（XY 结构域）；EF 手结构域和用于 Ca2+/脂质感应的 C2 结构域；以及调控性 SH2-SH2-SH3 结构域。激活后，PLC-γ1 将磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP2) 水解为肌醇 1,4,5-三磷酸 (IP3) 和二酰甘油 (DAG)。这些第二信使驱动细胞内钙释放和蛋白激酶 C (PKC) 激活，从而传递下游信号。高亲和力的 cSH2-pTyr783 相互作用可抑制自身抑制作用，从而稳定开放的、具有催化活性的构象，并放大 IP3/DAG 的生成。这维持着Ca2+振荡、PKC/ERK串扰、细胞骨架重塑、基因表达和趋化作用，尤其是在免疫细胞中。Tyr783的快速去磷酸化确保信号及时终止。磷酸化的PLCγ1对于血小板聚集、T细胞和B细胞活化以及RTK驱动的细胞增殖至关重要。Tyr783的异常磷酸化可导致免疫紊乱（例如，由功能获得性突变引起的重症联合免疫缺陷症），通过PLC信号过度激活导致血液系统恶性肿瘤，并驱动实体瘤的侵袭和血管生成。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:100000 - 1:200000 1:100
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 148 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Jurkat, Lane 2: Jurkat (pervanadate, 50mM, 5 min), Lane 3: Jurkat (pervanadate, 50mM, 5 min; alkaline phosphatase treated)