Phospho-RIP (Ser166) Antibody [J17A23] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-RIP (Ser166) Antibody [J17A23] 仅识别 Ser166 处磷酸化的内源性 RIP 蛋白水平。
背景	磷酸化 RIP (Ser166)，具体而言是受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶 1 (RIPK1)，是 RIP 激酶家族中的中心衔接激酶，调节 TNFR1 介导的炎症和细胞死亡。它具有 N 端激酶结构域（RIP 同源，在基础状态下具有自身抑制作用）、带有坏死性凋亡 RHIM 基序的中间结构域和募集 TRADD/FADD/caspase-8 的 C 端死亡结构域 (DD)。在 TAK1 启动后，激活环 (T-loop) 内的 Ser166 发生自身磷酸化，从而完全激活催化能力。 Ser166磷酸化（PIKK激酶的共有序列）诱导T环重定位、DFG基序有序化、C螺旋对接，并增强ATP/底物接近，从而在二级位点（Ser161/Thr169）发生反式自磷酸化，同时激活RHIM依赖的RIPK3募集至坏死体（复合物IIb）。它激活RIPK1激酶活性，驱动caspase-8/FADD依赖性细胞凋亡（复合物IIa），或在caspase抑制（例如TSZ/LZ/PZ刺激）下，驱动MLKL磷酸化/寡聚化以诱导坏死性凋亡。S166A突变体表现出坏死性凋亡/细胞凋亡减少、坏死体组装受损，并且尽管激酶结构域完整，却无法磷酸化RIPK3/MLKL。磷酸化Ser166维持炎症信号通路（通过IKK/NEMO募集激活NF-κB，促进细胞因子生成），同时在未解决的应激条件下使细胞趋于死亡；这在发病机制中至关重要，因为S166A敲入小鼠能够抵抗RIPK1依赖的皮肤炎症、肠道损伤、肝炎和全身性休克。其疾病相关性包括银屑病、炎症性肠病（IBD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等炎症性疾病，在这些疾病中，磷酸化Ser166可作为激酶激活的生物标志物；神经退行性疾病，可通过抑制Nec-1实现神经保护；以及癌症，在癌症中，磷酸化Ser166可通过生存偏倚导致免疫逃逸。

特异性

Phospho-RIP (Ser166) Antibody [J17A23] 仅识别 Ser166 处磷酸化的内源性 RIP 蛋白水平。

背景

磷酸化 RIP (Ser166)，具体而言是受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶 1 (RIPK1)，是 RIP 激酶家族中的中心衔接激酶，调节 TNFR1 介导的炎症和细胞死亡。它具有 N 端激酶结构域（RIP 同源，在基础状态下具有自身抑制作用）、带有坏死性凋亡 RHIM 基序的中间结构域和募集 TRADD/FADD/caspase-8 的 C 端死亡结构域 (DD)。在 TAK1 启动后，激活环 (T-loop) 内的 Ser166 发生自身磷酸化，从而完全激活催化能力。 Ser166磷酸化（PIKK激酶的共有序列）诱导T环重定位、DFG基序有序化、C螺旋对接，并增强ATP/底物接近，从而在二级位点（Ser161/Thr169）发生反式自磷酸化，同时激活RHIM依赖的RIPK3募集至坏死体（复合物IIb）。它激活RIPK1激酶活性，驱动caspase-8/FADD依赖性细胞凋亡（复合物IIa），或在caspase抑制（例如TSZ/LZ/PZ刺激）下，驱动MLKL磷酸化/寡聚化以诱导坏死性凋亡。S166A突变体表现出坏死性凋亡/细胞凋亡减少、坏死体组装受损，并且尽管激酶结构域完整，却无法磷酸化RIPK3/MLKL。磷酸化Ser166维持炎症信号通路（通过IKK/NEMO募集激活NF-κB，促进细胞因子生成），同时在未解决的应激条件下使细胞趋于死亡；这在发病机制中至关重要，因为S166A敲入小鼠能够抵抗RIPK1依赖的皮肤炎症、肠道损伤、肝炎和全身性休克。其疾病相关性包括银屑病、炎症性肠病（IBD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）等炎症性疾病，在这些疾病中，磷酸化Ser166可作为激酶激活的生物标志物；神经退行性疾病，可通过抑制Nec-1实现神经保护；以及癌症，在癌症中，磷酸化Ser166可通过生存偏倚导致免疫逃逸。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

78-82 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HT-29, Lane 2: HT-29 (Z-VAD, 20 μM, added 30 min prior to other cpds; hTNF-α, 20 ng/ml, 7 h; SM-164, 100 nM, 7 h)