Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) Antibody [C1L6] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) Antibody [C1L6] 仅在羧基末端结构域（CTD）七肽重复序列[Tyr1， Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6， Ser7]在Ser2和Ser5处双磷酸化时才能识别内源性 Rpb1 蛋白水平。
背景	RNA聚合酶II最大亚基Rpb1（Polr2A）的C端结构域（CTD）七肽残基Ser2和Ser5的磷酸化标志着真核生物转录周期中的一个中心调控节点，其中由串联的Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7重复序列组成的Rpb1 CTD，作为招募转录和RNA加工机制的动态平台。在启动子处，Rpb1 通过与 Mediator 和序列特异性转录因子的相互作用，以低磷酸化状态被募集，其向有效延伸的转变由两个主要的 CTD 激酶系统协调：TFIIH 的催化亚基 CDK7 在延伸早期磷酸化 Ser5，促进启动子清除和 5ʹ RNA 加帽酶和组蛋白 H3 Lys4 甲基转移酶的募集，从而建立与起始相容的染色质状态；而在延伸阶段后期，P-TEFb (CDK9) 依赖的 Ser2 磷酸化稳定了延伸复合物，促进了剪接和 3ʹ 末端加工因子的募集，并允许组蛋白 H3 Lys36 甲基化，从而支持有利于延伸的染色质。 CDK7 对早期转录区域的 Ser7 进行磷酸化，启动 snRNA 基因表达的特殊模块。其中，Ser7 磷酸化的 Rpb1 招募磷酸酶 RPAP2，RPAP2 使 Ser5 去磷酸化，生成双重 Ser2/Ser7 标记，促进整合体复合物在 snRNA 启动子处的组装，并通过 3ʹ 盒元件确保新生 snRNA 转录本的 3ʹ 末端有效切割，这与蛋白质编码 RNA 的 poly(A) 信号依赖性加工不同。

特异性

Phospho-Rpb1 CTD (Ser2/Ser5) Antibody [C1L6] 仅在羧基末端结构域（CTD）七肽重复序列[Tyr1， Ser2, Pro3, Thr4, Ser5, Pro6， Ser7]在Ser2和Ser5处双磷酸化时才能识别内源性 Rpb1 蛋白水平。

背景

RNA聚合酶II最大亚基Rpb1（Polr2A）的C端结构域（CTD）七肽残基Ser2和Ser5的磷酸化标志着真核生物转录周期中的一个中心调控节点，其中由串联的Tyr1-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7重复序列组成的Rpb1 CTD，作为招募转录和RNA加工机制的动态平台。在启动子处，Rpb1 通过与 Mediator 和序列特异性转录因子的相互作用，以低磷酸化状态被募集，其向有效延伸的转变由两个主要的 CTD 激酶系统协调：TFIIH 的催化亚基 CDK7 在延伸早期磷酸化 Ser5，促进启动子清除和 5ʹ RNA 加帽酶和组蛋白 H3 Lys4 甲基转移酶的募集，从而建立与起始相容的染色质状态；而在延伸阶段后期，P-TEFb (CDK9) 依赖的 Ser2 磷酸化稳定了延伸复合物，促进了剪接和 3ʹ 末端加工因子的募集，并允许组蛋白 H3 Lys36 甲基化，从而支持有利于延伸的染色质。 CDK7 对早期转录区域的 Ser7 进行磷酸化，启动 snRNA 基因表达的特殊模块。其中，Ser7 磷酸化的 Rpb1 招募磷酸酶 RPAP2，RPAP2 使 Ser5 去磷酸化，生成双重 Ser2/Ser7 标记，促进整合体复合物在 snRNA 启动子处的组装，并通过 3ʹ 盒元件确保新生 snRNA 转录本的 3ʹ 末端有效切割，这与蛋白质编码 RNA 的 poly(A) 信号依赖性加工不同。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	CHIP
1:1000	1:50	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

250 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: C2C12, Lane 2: H-4-II-E, Lane 3: COS-7