Phospho-SQSTM1/p62 (Ser349) Antibody (Rabbit mAb) [N16A3]

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生物描述

特异性 Phospho-SQSTM1/p62 (Ser349) Antibody (Rabbit mAb) [N16A3] 仅识别 Ser349 处磷酸化的内源性 SQSTM1/p62 蛋白水平。
背景 磷酸化SQSTM1/p62 (Ser349) 代表自噬衔接蛋白SQSTM1/p62的活性信号整合形式，其中KEAP1结合区内的丝氨酸残基被磷酸化，增强了该蛋白将选择性自噬与氧化还原响应性转录调控偶联的能力。SQSTM1/p62是一个模块化支架蛋白，其N端包含介导自身寡聚化的PB1结构域、中央LC3相互作用区和KEAP1相互作用区，以及C端泛素结合结构域，使其能够组装成相分离的液滴，从而浓缩多泛素化的货物、自噬机制和信号转导组分。 p62蛋白Ser349位点（小鼠为Ser351位点）的磷酸化发生在KEAP1相互作用区域，增强了p62与KEAP1的亲和力，促进了竞争性结合，从而将NRF2从KEAP1-CUL3泛素连接酶复合物中置换出来，并稳定NRF2。NRF2随后在细胞核内积累，激活抗氧化和细胞保护基因的转录。这种修饰在氧化应激过程中被诱导，并与其他磷酸化事件（例如Ser403位点的磷酸化）相互作用，增强p62与多聚泛素链的结合。因此，Ser349磷酸化的p62液滴作为平台，聚集泛素化的货物、KEAP1和自噬因子，协调NRF2的激活、货物的隔离和自噬降解。磷酸化p62（Ser349）标志着p62不仅作为受体选择性自噬泛素化蛋白、蛋白聚集体和受损细胞器，而且还主动重塑KEAP1-NRF2轴，使其向抗氧化和促生存转录程序转变，这种偶联有助于细胞在慢性应激下的适应。在癌症中，持续或升高的Ser349磷酸化与NRF2活性增强、抗癌药物耐药性以及肝细胞癌和其他肿瘤细胞增殖能力增强相关。磷酸化Ser349 p62在p62阳性包涵体中富集，支持生存信号传导和蛋白质稳态改变，这使得该表位成为肿瘤发生背景下NRF2相关自噬信号传导的有效指标。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:30 1:100 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 48 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: U-2 OS, Lane 2: U-2 OS (KO SQSTM1), Lane 3: HeLa, Lane 4: HeLa (MG-132, 2μM, 18 h)