Phospho-Tau (Ser422) Antibody [L19H1] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Tau (Ser422) Antibody [L19H1] 仅识别 Ser422 处磷酸化的内源性 Tau 蛋白水平。
背景	磷酸化Tau蛋白（Ser422）是微管相关蛋白Tau（MAPT）的一种疾病相关翻译后修饰。Tau蛋白是六种脑部亚型（约352-441个氨基酸）之一，其正常功能是通过N端投射结构域、富含脯氨酸的区域（P1/P2基序）、四个微管结合重复序列（R1-R4）和C端尾部来稳定轴突微管。Ser422位于R2重复序列中，该重复序列侧翼是微管蛋白结合所必需的KXGS基序；pSer422位点的磷酸化（由S422E假磷酸化模拟）可增强SDS稳定的二聚体形成，延长聚集成核时间，暴露磷酸酶激活结构域（PAD，氨基酸2-18），并改变Tau蛋白的构象，但不改变总聚集体产量。 pSer422 tau 单体抑制顺行驱动蛋白-1依赖的快速轴突运输 (FAT)，而其聚集体则独特地阻断顺行和逆行 FAT，这与未修饰的 tau 不同，从而破坏了囊泡、线粒体和对神经元存活至关重要的信号分子的轴突运输。这种修饰与阿尔茨海默病 (AD) 前驱期脑中的认知功能下降、神经毡丝和寡聚 tau 相关，激活 PP1-GSK3β 通路，加剧 tau 蛋白病中的微管解聚、突触丢失和神经退行性变。

特异性

Phospho-Tau (Ser422) Antibody [L19H1] 仅识别 Ser422 处磷酸化的内源性 Tau 蛋白水平。

背景

磷酸化Tau蛋白（Ser422）是微管相关蛋白Tau（MAPT）的一种疾病相关翻译后修饰。Tau蛋白是六种脑部亚型（约352-441个氨基酸）之一，其正常功能是通过N端投射结构域、富含脯氨酸的区域（P1/P2基序）、四个微管结合重复序列（R1-R4）和C端尾部来稳定轴突微管。Ser422位于R2重复序列中，该重复序列侧翼是微管蛋白结合所必需的KXGS基序；pSer422位点的磷酸化（由S422E假磷酸化模拟）可增强SDS稳定的二聚体形成，延长聚集成核时间，暴露磷酸酶激活结构域（PAD，氨基酸2-18），并改变Tau蛋白的构象，但不改变总聚集体产量。 pSer422 tau 单体抑制顺行驱动蛋白-1依赖的快速轴突运输 (FAT)，而其聚集体则独特地阻断顺行和逆行 FAT，这与未修饰的 tau 不同，从而破坏了囊泡、线粒体和对神经元存活至关重要的信号分子的轴突运输。这种修饰与阿尔茨海默病 (AD) 前驱期脑中的认知功能下降、神经毡丝和寡聚 tau 相关，激活 PP1-GSK3β 通路，加剧 tau 蛋白病中的微管解聚、突触丢失和神经退行性变。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:10000 - 1:20000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

50-100 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

Phospho-Tau (Ser422) Antibody [L19H1]

生物描述

使用信息

文献参考

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