Phospho-TrkA (Y785)/TrkB (Y816) Antibody [G6J11]

目录号：F0652

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生物描述

特异性 Phospho-TrkA (Y785)/TrkB (Y816) Antibody [G6J11] 仅当 TrkA 和 TrkB 蛋白分别在 Tyr785 和 Tyr816 位点磷酸化时，才能检测内源性总 TrkA 和 TrkB 蛋白的水平。
背景 磷酸化TrkA (Y785)/TrkB (Y816) 是指Trk受体酪氨酸激酶（TrkA、TrkB、TrkC家族）C端胞内尾部保守的磷酸酪氨酸位点，由神经营养因子激活，TrkA由NGF激活，TrkB由BDNF/NT4激活，通过二聚化和激酶自身磷酸化调节神经元存活、分化、突触可塑性和轴突生长。 TrkA 蛋白包含一个胞外配体结合域、一个跨膜螺旋、一个近膜区、一个蛋白激酶结构域（其激活环酪氨酸残基如 Y674/675）以及一个含有 Y785（相当于 TrkB 中的 Y816）的 C 端尾部。Y785 磷酸化后，可通过其 SH2 结构域（不同于 Y490 的 Shc 结合位点）与磷脂酶 Cγ1 (PLCγ) 结合。Y785/pY816 位点的磷酸化主要激活 PLCγ，进而触发 IP3 介导的 Ca2+ 释放、PKC 激活以及随后的 Ras-MAPK/ERK 信号通路，从而促进神经突生长、细胞周期调控和基因转录。此外，该磷酸化还影响神经元兴奋性和突触强化，且该作用独立于其他位点激活的 MAPK 通路。异常磷酸化通过配体非依赖性二聚化驱动神经母细胞瘤和其他癌症中的致癌信号传导；而在神经系统中，它支持成年突触可塑性，但过度激活会导致慢性疼痛和神经退行性变。破坏Y785的突变会消除PLCγ反应，但不影响Shc/MAPK。

使用信息

抗体应用 WB 稀释比例
WB
1:1000
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 140 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

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