Phospho-Tuberin (Ser939) Antibody [B6P7] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-Tuberin (Ser939) Antibody [B6P7] 仅识别 Ser939 处磷酸化的内源性 Tuberin 总蛋白水平。
背景	磷酸化块茎蛋白 (Ser939) 是指块茎蛋白（TSC2 基因产物）的磷酸化形式，位于丝氨酸残基 939 位，该位点受生长因子信号调控。块茎蛋白是一种抑癌蛋白，含有针对 Rheb 的 GAP 活性功能域，并与错构瘤蛋白 (TSC1) 形成复合物，从而抑制 mTORC1 信号传导并控制细胞生长。块茎蛋白包含一个与错构瘤蛋白结合的 N 端区域、一个与细胞周期蛋白 B1 相互作用的中心区域、一个用于蛋白质间相互作用的亮氨酸拉链 (LZ) 和卷曲螺旋 (CC) 结构域，以及一个对 Rheb 抑制至关重要的 C 端 GTP 酶激活 (GAP) 结构域。块茎蛋白主要在各种组织中表达，尤其是在脑、肾和皮肤中，它能够抑制肿瘤形成。在生长因子刺激下，AKT和TACC3等激酶会磷酸化Ser939，从而促进14-3-3蛋白的结合。这种磷酸化不会削弱马铃薯蛋白固有的GAP活性，但会导致其从膜相关区室（其在膜相关区室抑制Rheb）转位至胞质溶胶，从而有效缓解mTOR抑制。因此，Ser939磷酸化在丝裂原刺激期间调节mTORC1信号传导中起关键作用，并且在细胞分裂期间将马铃薯蛋白定位至有丝分裂装置，从而将细胞生长信号与正确的胞质分裂和细胞周期进程联系起来。

特异性

Phospho-Tuberin (Ser939) Antibody [B6P7] 仅识别 Ser939 处磷酸化的内源性 Tuberin 总蛋白水平。

背景

磷酸化块茎蛋白 (Ser939) 是指块茎蛋白（TSC2 基因产物）的磷酸化形式，位于丝氨酸残基 939 位，该位点受生长因子信号调控。块茎蛋白是一种抑癌蛋白，含有针对 Rheb 的 GAP 活性功能域，并与错构瘤蛋白 (TSC1) 形成复合物，从而抑制 mTORC1 信号传导并控制细胞生长。块茎蛋白包含一个与错构瘤蛋白结合的 N 端区域、一个与细胞周期蛋白 B1 相互作用的中心区域、一个用于蛋白质间相互作用的亮氨酸拉链 (LZ) 和卷曲螺旋 (CC) 结构域，以及一个对 Rheb 抑制至关重要的 C 端 GTP 酶激活 (GAP) 结构域。块茎蛋白主要在各种组织中表达，尤其是在脑、肾和皮肤中，它能够抑制肿瘤形成。在生长因子刺激下，AKT和TACC3等激酶会磷酸化Ser939，从而促进14-3-3蛋白的结合。这种磷酸化不会削弱马铃薯蛋白固有的GAP活性，但会导致其从膜相关区室（其在膜相关区室抑制Rheb）转位至胞质溶胶，从而有效缓解mTOR抑制。因此，Ser939磷酸化在丝裂原刺激期间调节mTORC1信号传导中起关键作用，并且在细胞分裂期间将马铃薯蛋白定位至有丝分裂装置，从而将细胞生长信号与正确的胞质分裂和细胞周期进程联系起来。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000 - 1:10000

反应性

Human, Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

201 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：250 mA, 180 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：250 mA, 180 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: SH-SY5Y (Okadaic Acid, 200nM and Calyculin A, 1uM, 60 min), Lane 3: SH-SY5Y (Okadaic Acid, 200nM and Calyculin A, 1uM, 60 min; phosphatase-treated)