Phospho-ULK1 (Ser638) Antibody (Rabbit mAb) [F14B19] Datasheet

生物描述

特异性	Phospho-ULK1 (Ser638) Antibody (Rabbit mAb) [F14B19] 仅识别 Ser638 处磷酸化的内源性 ULK1 蛋白水平。
背景	Ser638位点的磷酸化ULK1代表了UNC-51样激酶1的营养和应激调节状态，UNC-51样激酶1是一种Atg1家族丝氨酸/苏氨酸激酶，它形成核心自噬起始ULK1复合物，并将上游mTORC1和AMPK信号通路与下游自噬体生物合成、隔离膜扩张和细胞器清除联系起来。ULK1包含一个N端激酶结构域、一个富含丝氨酸/脯氨酸的中央连接区和一个保守的C端结构域，该结构域可作为ATG13、FIP200/RB1CC1和ATG101的支架，连接区内的多个磷酸化位点整合了来自mTORC1和AMPK的信号； Ser638 位于该调控连接区，在营养充足的条件下，mTORC1 会与 Ser757 协同磷酸化 Ser638，并且在某些应激情况下，AMPK 也会靶向 Ser638，这表明 Ser638 是一个双向调控位点，参与 ULK1 在非活性和活性构象之间的转换。在合成代谢、生长因子丰富的条件下，活性 mTORC1 与 ULK1 复合物结合，并在 mTOR 敏感位点磷酸化 ULK1 的 Ser638 和 Ser757 以及 ATG13，这些事件会降低 ULK1 激酶活性，破坏 ULK1-AMPK 相互作用，并将复合物滞留在非起始位置，从而抑制自噬起始；在急性营养匮乏或能量压力下，mTORC1 受到抑制并解离，Ser638 及相关抑制位点发生去磷酸化，AMPK 被激活并直接磷酸化 ULK1 的促自噬位点（Ser317、Ser555、Ser777），促进 ULK1 复合物重新定位到自噬体前膜并诱导自噬。最近对 Atg1/ULK1 调控机制的分析表明，ULK1 磷酸化 ATG9 以控制隔离膜的扩张，而 Ser638 磷酸化参与调节这种活性：mTORC1 介导的 Ser638 及其邻近残基的磷酸化会降低 ULK1 依赖的 ATG9 磷酸化并限制吞噬泡的生长，而 AMPK 相关的 Ser638 调控与 ULK1 对 ATG9 的活性增强以及应激反应中自噬体形成增加有关，这使得磷酸化的 Ser638 处于营养感知和膜扩张控制之间的关键节点。 ULK1除了能磷酸化起始复合物之外，还能磷酸化其他底物，包括VPS34 III类PI3K复合物中的Beclin-1和线粒体自噬受体BNIP3。磷酸化状态分析表明，Ser638是更广泛的磷酸化密码的一部分，该密码调节ULK1的底物偏好性及其从自噬体成核到成熟和细胞器选择性途径（例如线粒体自噬）的转变。在癌症中，ULK1介导的自噬通过支持代谢灵活性、应激适应以及在缺氧和营养限制下的存活，从而促进耐药性。关于ULK1在治疗耐药性中的作用的综述强调，mTORC1和AMPK的活性通过ULK1连接位点（包括Ser638）发挥作用，决定了治疗期间自噬是被抑制还是激活；靶向ULK1或其磷酸化调控（包括调节Ser638磷酸化）的药物疗法正在研究中，旨在提高肿瘤对化疗和放疗的敏感性。

特异性

Phospho-ULK1 (Ser638) Antibody (Rabbit mAb) [F14B19] 仅识别 Ser638 处磷酸化的内源性 ULK1 蛋白水平。

背景

Ser638位点的磷酸化ULK1代表了UNC-51样激酶1的营养和应激调节状态，UNC-51样激酶1是一种Atg1家族丝氨酸/苏氨酸激酶，它形成核心自噬起始ULK1复合物，并将上游mTORC1和AMPK信号通路与下游自噬体生物合成、隔离膜扩张和细胞器清除联系起来。ULK1包含一个N端激酶结构域、一个富含丝氨酸/脯氨酸的中央连接区和一个保守的C端结构域，该结构域可作为ATG13、FIP200/RB1CC1和ATG101的支架，连接区内的多个磷酸化位点整合了来自mTORC1和AMPK的信号； Ser638 位于该调控连接区，在营养充足的条件下，mTORC1 会与 Ser757 协同磷酸化 Ser638，并且在某些应激情况下，AMPK 也会靶向 Ser638，这表明 Ser638 是一个双向调控位点，参与 ULK1 在非活性和活性构象之间的转换。在合成代谢、生长因子丰富的条件下，活性 mTORC1 与 ULK1 复合物结合，并在 mTOR 敏感位点磷酸化 ULK1 的 Ser638 和 Ser757 以及 ATG13，这些事件会降低 ULK1 激酶活性，破坏 ULK1-AMPK 相互作用，并将复合物滞留在非起始位置，从而抑制自噬起始；在急性营养匮乏或能量压力下，mTORC1 受到抑制并解离，Ser638 及相关抑制位点发生去磷酸化，AMPK 被激活并直接磷酸化 ULK1 的促自噬位点（Ser317、Ser555、Ser777），促进 ULK1 复合物重新定位到自噬体前膜并诱导自噬。最近对 Atg1/ULK1 调控机制的分析表明，ULK1 磷酸化 ATG9 以控制隔离膜的扩张，而 Ser638 磷酸化参与调节这种活性：mTORC1 介导的 Ser638 及其邻近残基的磷酸化会降低 ULK1 依赖的 ATG9 磷酸化并限制吞噬泡的生长，而 AMPK 相关的 Ser638 调控与 ULK1 对 ATG9 的活性增强以及应激反应中自噬体形成增加有关，这使得磷酸化的 Ser638 处于营养感知和膜扩张控制之间的关键节点。 ULK1除了能磷酸化起始复合物之外，还能磷酸化其他底物，包括VPS34 III类PI3K复合物中的Beclin-1和线粒体自噬受体BNIP3。磷酸化状态分析表明，Ser638是更广泛的磷酸化密码的一部分，该密码调节ULK1的底物偏好性及其从自噬体成核到成熟和细胞器选择性途径（例如线粒体自噬）的转变。在癌症中，ULK1介导的自噬通过支持代谢灵活性、应激适应以及在缺氧和营养限制下的存活，从而促进耐药性。关于ULK1在治疗耐药性中的作用的综述强调，mTORC1和AMPK的活性通过ULK1连接位点（包括Ser638）发挥作用，决定了治疗期间自噬是被抑制还是激活；靶向ULK1或其磷酸化调控（包括调节Ser638磷酸化）的药物疗法正在研究中，旨在提高肿瘤对化疗和放疗的敏感性。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

113 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: Hela