Phospho-Vimentin (Ser56) Antibody (Rabbit mAb) [J12E11]

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生物描述

特异性 Phospho-Vimentin (Ser56) Antibody (Rabbit mAb) [J12E11] 仅识别 Ser56 处磷酸化的内源性 Vimentin 蛋白水平。
背景 磷酸化波形蛋白（Ser56）是指III类中间丝蛋白波形蛋白的一种受调控的翻译后修饰状态，其中其N端头部结构域内的丝氨酸残基被磷酸化，从而改变丝状结构的组织方式，并将波形蛋白网络与控制细胞收缩、迁移、分泌和基质重塑的信号通路连接起来。波形蛋白单体包含一个N端头部区域、一个介导二聚体和丝状结构组装的中央α螺旋卷曲螺旋杆状结构以及一个C端尾部；Ser56位于头部，其磷酸化状态强烈影响不溶性丝状束和可溶性亚基之间的平衡，从而调节中间丝的动力学。在平滑肌中，激动剂刺激（例如血清素）激活p21激活激酶（PAK），后者直接磷酸化波形蛋白的Ser56位点。这种修饰增加了可溶性波形蛋白与不溶性波形蛋白的比例，并驱动波形蛋白网络的空间重组。表达不可磷酸化的S56A突变体可阻止Ser56的磷酸化，维持丝状结构的稳定性，减少波形蛋白的解聚，并阻断Crk相关底物（CAS）从细胞骨架波形蛋白上的解离。这表明Ser56的磷酸化对于激动剂诱导的丝状结构重排和CAS信号复合物的释放是必需的。这些变化反过来又影响PAK的活性，因为Ser56的磷酸化和可溶性CAS的增加会反向调节PAK的激活，从而形成一个波形蛋白-CAS-PAK环路。在该环路中，磷酸化的Ser56在平滑肌收缩和细胞迁移过程中同时控制着结构重塑和激酶信号传导。在中性粒细胞中，GTP诱导的分泌需要波形蛋白的快速重塑，而Cdk5已被证实是该过程中Ser56的激酶：抑制或基因操作Cdk5会降低波形蛋白Ser56的磷酸化水平，损害波形蛋白丝的重组并减弱分泌，这表明磷酸化Ser56是连接上游GTP/Cdk5信号通路与急性炎症反应中颗粒动员的关键介质。更广泛地说，磷酸化Ser56是波形蛋白头部一个更大的磷酸化密码子的一部分，该密码子中的多个丝氨酸位点在有丝分裂、胞质分裂和迁移过程中发生磷酸化，并协调丝状体的解聚、重组以及与巢蛋白和LARP6等伙伴蛋白的相互作用，这些相互作用会影响胶原蛋白mRNA的稳定性和基质沉积。在肝星状细胞中，通过药物调控ERK/Akt和Rho信号通路，可以改变波形蛋白（vimentin）上特定的丝氨酸磷酸化模式，并在纤维化过程中改变细胞增殖、迁移和黏着斑结构。这与以下模型相符：Ser56及其邻近位点作为下游效应分子，波形蛋白通过整合ERK/Akt和Rho GTP酶信号来调控细胞骨架的相互作用和纤维化进展。波形蛋白Ser56的磷酸化标志着中间丝网络处于一种动态调控状态，这种状态会影响丝状体的溶解度、空间分布、与CAS等信号蛋白的相互作用以及细胞的收缩、迁移和分泌等功能。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:30 1:1000
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 54 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail, 磷酸酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液（建议使用 5% BSA溶液）中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa, Lane 2: HeLa (Nocodazole, 24 h)