PINK1 Antibody [M4A21]

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生物描述

特异性 PINK1 Antibody [M4A21] 可检测内源性 PINK1 总蛋白水平。
背景 PINK1（PTEN诱导激酶1）是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，对线粒体质量控制和细胞稳态至关重要，尤其在神经元细胞内。它属于一个独特的激酶家族，其特征是其激酶结构域内存在延伸插入，包括三个对其活性和底物识别至关重要的特定环状插入。PINK1包含一个N端线粒体靶向序列、一个将其锚定在线粒体外膜（OMM）上的跨膜螺旋，以及一个具有稳定所必需的C端延伸的激酶结构域。当线粒体受到损伤（例如去极化或活性氧积累）时，PINK1会在OMM上积累并发生自身磷酸化，尤其是在一个保守的丝氨酸残基（人类中为Ser228）上，从而引发构象变化，使其能够磷酸化Ser65位的泛素。这种磷酸化通过激活E3泛素连接酶Parkin来标记受损的线粒体，从而启动线粒体自噬，使其得以清除。PINK1的活性受其与线粒体转位酶的相互作用及其固有结构特征（包括由环插入形成的碗状泛素结合位点）的调控。PINK1突变会导致激酶功能丧失、线粒体质量控制受损，并与常染色体隐性早发性帕金森病存在致病关系。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:30 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 63 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。
 
IF
实验步骤：
 
标本制备
1. 吸出液体，然后用 1X PBS 稀释的 4% 多聚甲醛覆盖细胞至 2-3 mm 的深度。
注意：多聚甲醛有毒，只能在通风橱中使用。
2. 室温固定细胞 15 分钟。
3. 吸出固定液，用 1X PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。
4. 继续进行免疫染色。
 
免疫染色
1. 添加封闭缓冲液并在室温下孵育 60 分钟。
2. 按照建议在抗体稀释缓冲液中制备一抗稀释液。
3. 吸出封闭液，加入制备好的一抗稀释液。
4. 4°C 孵育过夜。
5. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
6. 将样本放入用抗体稀释缓冲液稀释的荧光染料偶联二抗中，室温避光孵育 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。
8. 使用带有 DAPI 的封固剂封固载玻片并盖上盖玻片。
9. 为获得最佳效果，请让封固剂在室温下固化过夜。 如需长期保存，请将载玻片平放在 23°C 避光保存。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HEK-293, Lane 2: HEK-293 (CCCP, 10 µM, 24 h)