PKC β Antibody (Rabbit mAb) [C22A12]

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生物描述

特异性 PKC β Antibody (Rabbit mAb) [C22A12] 可检测内源性 PKC β 总蛋白水平。
背景 PKCβ是丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的一种经典蛋白激酶C亚型，它响应二酰甘油和钙离子，参与调控细胞生长、存活、分化、细胞骨架动力学和分泌反应的信号级联反应。该酶包含一个N端调控区，该调控区由结合二酰甘油和佛波酯的C1结构域和感知钙离子和阴离子磷脂的C2结构域组成；此外，它还包含一个C端催化结构域，该结构域在富含酸性磷脂的膜上释放自身抑制性假底物片段后，可磷酸化底物上的丝氨酸和苏氨酸残基。 PKCβ1的激活源于受体触发的磷脂酶C依赖性二酰甘油生成和钙动员，进而导致其从胞质溶胶转位至质膜和其他膜区室，并在这些膜区室中磷酸化参与细胞骨架重塑、离子转运、基因表达和代谢的靶蛋白。PKCβ1参与生长因子信号传导；表皮生长因子激活PKCβ1可促进F-肌动蛋白细胞骨架的重组、屏障细胞结构的维持以及通过增强钙外流来维持细胞内钙的正常化，从而将该亚型与氧化或炎症应激期间的细胞骨架保护和钙稳态联系起来。 PKC β1 还参与调控包括血脑屏障在内的特殊屏障处的转运蛋白和通道。在血脑屏障中，PKC β1 的药理学激活可调节 P-糖蛋白活性并改变药物外排能力，从而将该激酶与中枢神经系统药物递送的调控联系起来。在更广泛的信号网络中，PKC β 亚型通过磷酸化或调控上游和中间组分与 MAPK/ERK 和 PI3K/Akt 通路相互作用，从而影响免疫细胞和非免疫细胞中的转录因子激活、细胞周期进程和存活信号传导。PKC β 活性升高与代谢性疾病中的血管功能障碍相关，在高血糖状态下，二酰甘油驱动的 PKC β 激活会导致内皮通透性、细胞外基质生成和血管活性介质表达的改变，而这些改变是微血管并发症的基础。在淋巴恶性肿瘤中，PKC-β 表达经常增加，弥漫性大 B 细胞淋巴瘤中高水平的 PKC-β 与不良预后相关，并与支持 B 细胞生长和抵抗凋亡的生存途径相一致，这推动了人们对 PKC-β 靶向治疗策略的兴趣。

使用信息

抗体应用 IHC, IF, FCM 稀释比例
IHC IF FCM
1:100 1:100 1:200
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 77 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: K562, Lane 2: Jurkat, Lane 3: Mouse brain