PKR Antibody [F1M21] Datasheet

生物描述

特异性	PKR Antibody [F1M21] 可检测内源性 PKR 总蛋白水平。
背景	蛋白激酶R (PKR) 是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，由人类2号染色体上的EIF2AK2基因编码。PKR由551个氨基酸组成，在调节mRNA翻译、转录调控、细胞凋亡和细胞增殖中起着关键作用。该激酶的失调与多种病理学机制有关，包括癌症、代谢紊乱、神经退行性疾病和炎症性疾病。PKR的结构包括N端双链RNA结合结构域(dsRBD)，该结构域由两个串联的dsRNA结合基序(dsRBM1和dsRBM2)组成，这两个基序之间由一个短连接体隔开，随后是一个柔性区域，连接到C端激酶结构域。该催化结构域介导二聚化和激酶活性，从而实现靶标底物的磷酸化。 PKR 的激活通常发生在病毒感染产生的双链 RNA (dsRNA) 的刺激下，该 dsRNA 会诱导激活环内关键残基 Thr446 和 Thr451 发生二聚化，随后发生自身磷酸化。Thr451 突变会消除酶活性，而 Thr446 的替换则会使其部分恢复功能。除病毒 RNA 外，PKR 还可受多种应激相关信号的刺激，包括细菌脂多糖（通过 TLR4）、促炎细胞因子（TNF-α、IL-1、IFN-γ）、氧化应激、钙通量、营养物质超载、DNA 损伤、内质网内未折叠蛋白的积累，以及亚砷酸盐、衣霉素、毒胡萝卜素和过氧化氢等细胞应激源。 PKR 也可受宿主衍生因子调控，包括生长因子（例如 PDGF）、肝素和热休克蛋白。功能上，PKR 是四种激酶之一，它们通过磷酸化真核起始因子 2α (eIF2α) 来调节蛋白质合成，从而抑制应激条件下的整体翻译。除了翻译调控外，PKR 还可以通过参与 FADD–caspase-8–caspase-3 和 caspase-9–APAF1 通路，独立于 eIF2α 触发细胞凋亡。通过整合来自病毒、炎症、代谢和机械应激源的信号，PKR 成为细胞应激反应和免疫防御的中心枢纽。

特异性

PKR Antibody [F1M21] 可检测内源性 PKR 总蛋白水平。

背景

蛋白激酶R (PKR) 是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，由人类2号染色体上的EIF2AK2基因编码。PKR由551个氨基酸组成，在调节mRNA翻译、转录调控、细胞凋亡和细胞增殖中起着关键作用。该激酶的失调与多种病理学机制有关，包括癌症、代谢紊乱、神经退行性疾病和炎症性疾病。PKR的结构包括N端双链RNA结合结构域(dsRBD)，该结构域由两个串联的dsRNA结合基序(dsRBM1和dsRBM2)组成，这两个基序之间由一个短连接体隔开，随后是一个柔性区域，连接到C端激酶结构域。该催化结构域介导二聚化和激酶活性，从而实现靶标底物的磷酸化。 PKR 的激活通常发生在病毒感染产生的双链 RNA (dsRNA) 的刺激下，该 dsRNA 会诱导激活环内关键残基 Thr446 和 Thr451 发生二聚化，随后发生自身磷酸化。Thr451 突变会消除酶活性，而 Thr446 的替换则会使其部分恢复功能。除病毒 RNA 外，PKR 还可受多种应激相关信号的刺激，包括细菌脂多糖（通过 TLR4）、促炎细胞因子（TNF-α、IL-1、IFN-γ）、氧化应激、钙通量、营养物质超载、DNA 损伤、内质网内未折叠蛋白的积累，以及亚砷酸盐、衣霉素、毒胡萝卜素和过氧化氢等细胞应激源。 PKR 也可受宿主衍生因子调控，包括生长因子（例如 PDGF）、肝素和热休克蛋白。功能上，PKR 是四种激酶之一，它们通过磷酸化真核起始因子 2α (eIF2α) 来调节蛋白质合成，从而抑制应激条件下的整体翻译。除了翻译调控外，PKR 还可以通过参与 FADD–caspase-8–caspase-3 和 caspase-9–APAF1 通路，独立于 eIF2α 触发细胞凋亡。通过整合来自病毒、炎症、代谢和机械应激源的信号，PKR 成为细胞应激反应和免疫防御的中心枢纽。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

74 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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