PLK2 Antibody (Rabbit mAb) [M21F17] Datasheet

生物描述

特异性	PLK2 Antibody (Rabbit mAb) [M21F17] 可检测内源性 PLK2 总蛋白水平。
背景	Polo样激酶2 (PLK2)，又称血清和糖皮质激素诱导激酶SNK，是polo样激酶家族中的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过整合p53依赖性检查点调控、中心粒复制和小GTP酶介导的突触可塑性，将细胞周期控制和神经元信号传导联系起来。该蛋白具有PLK家族的典型结构，包含一个N端催化激酶结构域和C端polo盒结构域，后者能够识别预磷酸化基序并将PLK2定位到特定的亚细胞结构，从而实现对参与中心体复制、纺锤体检查点功能和Ras/Rap信号复合物的底物的特异性磷酸化。在细胞周期中，PLK2 在 G1/S 期交界处和早期有丝分裂事件中发挥作用，其激酶活性有助于中心粒的形成和精确复制；其 p53 诱导的转录调控将中心体复制与 DNA 损伤和复制检查点联系起来，使 PLK2 参与在增殖和应激条件下保护基因组完整性的通路。在神经元中，PLK2 通过协调兴奋性突触处 Ras 和 Rap 小 GTP 酶的活性平衡，发挥抑制过度兴奋的稳态抑制作用和结构可塑性的关键组织作用；该激酶磷酸化Ras激活因子RASGRF1和Rap抑制剂SIPA1L1以促进其降解，同时磷酸化Rap激活因子RAPGEF2和Ras抑制剂SYNGAP1以增强其功能，从而使信号从Ras转向Rap，进而驱动活动依赖性树突棘重塑并调节突触强度。这种对GEF和GAP样调节因子的双向调控表明，PLK2是Ras-ERK和Rap依赖性级联反应的上游时序和增益调节因子，这些级联反应影响AMPA受体转运、树突棘密度和记忆相关回路的精细化。PLK2还修饰α-突触核蛋白的调控位点，影响其周转和聚集，将该激酶与限制毒性蛋白积累的蛋白稳态机制联系起来，并提示PLK2活性、自噬性α-突触核蛋白清除和突触核蛋白病中的神经元恢复力之间存在功能性相互作用。 PLK2 表达表现出应激反应激酶的特征，具有依赖于环境的肿瘤抑制特性；其 p53 驱动的诱导以及在中心粒复制和检查点控制中的作用，将 PLK2 的缺失或沉默与中心体异常、细胞周期失调和化疗耐药性联系起来，而 PLK2 活性的保留或升高与特定癌症情况下治疗反应的改善相关。

特异性

PLK2 Antibody (Rabbit mAb) [M21F17] 可检测内源性 PLK2 总蛋白水平。

背景

Polo样激酶2 (PLK2)，又称血清和糖皮质激素诱导激酶SNK，是polo样激酶家族中的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它通过整合p53依赖性检查点调控、中心粒复制和小GTP酶介导的突触可塑性，将细胞周期控制和神经元信号传导联系起来。该蛋白具有PLK家族的典型结构，包含一个N端催化激酶结构域和C端polo盒结构域，后者能够识别预磷酸化基序并将PLK2定位到特定的亚细胞结构，从而实现对参与中心体复制、纺锤体检查点功能和Ras/Rap信号复合物的底物的特异性磷酸化。在细胞周期中，PLK2 在 G1/S 期交界处和早期有丝分裂事件中发挥作用，其激酶活性有助于中心粒的形成和精确复制；其 p53 诱导的转录调控将中心体复制与 DNA 损伤和复制检查点联系起来，使 PLK2 参与在增殖和应激条件下保护基因组完整性的通路。在神经元中，PLK2 通过协调兴奋性突触处 Ras 和 Rap 小 GTP 酶的活性平衡，发挥抑制过度兴奋的稳态抑制作用和结构可塑性的关键组织作用；该激酶磷酸化Ras激活因子RASGRF1和Rap抑制剂SIPA1L1以促进其降解，同时磷酸化Rap激活因子RAPGEF2和Ras抑制剂SYNGAP1以增强其功能，从而使信号从Ras转向Rap，进而驱动活动依赖性树突棘重塑并调节突触强度。这种对GEF和GAP样调节因子的双向调控表明，PLK2是Ras-ERK和Rap依赖性级联反应的上游时序和增益调节因子，这些级联反应影响AMPA受体转运、树突棘密度和记忆相关回路的精细化。PLK2还修饰α-突触核蛋白的调控位点，影响其周转和聚集，将该激酶与限制毒性蛋白积累的蛋白稳态机制联系起来，并提示PLK2活性、自噬性α-突触核蛋白清除和突触核蛋白病中的神经元恢复力之间存在功能性相互作用。 PLK2 表达表现出应激反应激酶的特征，具有依赖于环境的肿瘤抑制特性；其 p53 驱动的诱导以及在中心粒复制和检查点控制中的作用，将 PLK2 的缺失或沉默与中心体异常、细胞周期失调和化疗耐药性联系起来，而 PLK2 活性的保留或升高与特定癌症情况下治疗反应的改善相关。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

78 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 Tris-Triton Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HCT 116, Lane 2: HCT 116 (Doxorubicin, 0.5 μM, 24 h)