PRMT4/CARM1 Antibody [J8A9]

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生物描述

特异性 PRMT4/CARM1 Antibody [J8A9] 可检测内源性 PRMT4/CARM1 总蛋白水平。
背景 PRMT4，又称 CARM1（辅激活因子相关精氨酸甲基转移酶 1），是一种 I 型蛋白精氨酸甲基转移酶，它以 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 为甲基供体，催化精氨酸残基的不对称二甲基化，其独特之处在于靶向富含脯氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸 (PGM) 的基序，而不是其他 PRMT 所偏好的富含甘氨酸-精氨酸的结构域。 CARM1由一个N端结构域、一个介导蛋白质相互作用的PHD样锌指同源区、一个约340个氨基酸残基的中央催化核心组成。该催化核心包含保守的PRMT基序（包括IxxW、DxxY、SExxMGLG、THW、QxWxYDPFxR和DxxPxWxxFxxH）以及一些关键残基，例如Glu258和Asp305。这些残基与SAM结合口袋共同作用，使底物精氨酸胍基发生甲基化反应。该催化区域两侧是C端转录激活结构域，该结构域促进辅激活因子的募集。 CARM1的主要功能是甲基化组蛋白H3的第17和26位精氨酸残基，从而促进核受体（如ERα、RAR和AR）与p300/CBP等共激活因子协同作用，激活转录，进而增强染色质可及性和分化过程中的基因表达。CARM1还能修饰包括SRC-3、HuR和CBP在内的非组蛋白底物，影响mRNA的剪接、稳定性、通过核旁斑的输出、自噬、代谢和信号转导。在生物学上，CARM1通过抑制Rex1等多能性基因并激活CRABP2和NR2F1等维甲酸反应靶基因，在维甲酸诱导的胚胎干细胞分化为胚外内胚层中发挥关键作用。它还通过剪接位点附近的H3R17甲基化影响前体mRNA的加工，并定位于核斑和核旁斑，在那里调控RNA代谢。CARM1的过表达与乳腺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤的不良预后相关，它通过增强类固醇信号传导和促进细胞增殖来促进肿瘤发生。CARM1的活性受磷酸化、O-GlcNAc糖基化和泛素化等翻译后修饰的调控，选择性抑制剂已在体内显示出抗肿瘤疗效。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:50 1:200 - 1:400
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 63 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

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