Progerin Antibody [J17D10] Datasheet

生物描述

特异性	Progerin Antibody [J17D10] 可检测内源性 Progerin 总蛋白水平。
背景	早衰蛋白（层粘蛋白AΔ50）是一种致病性的607个氨基酸的法尼基化截短突变体，由LMNA基因中一个隐蔽剪接位点的激活（c.1824C>T，G608G）产生，该位点消除了正常层粘蛋白A成熟所需的ZMPSTE24切割位点。因此，早衰蛋白保留了C端CaaX（CSIM）法尼基化基序，但缺失了647-656位氨基酸残基，从而阻止了去法尼基化，导致其永久锚定于核内膜。早衰蛋白的N端头部、中央α螺旋杆状结构域和Ig折叠结构域与野生型核纤层蛋白A/C相似，但其异常的法尼基化作用会促进毒性聚集体的形成、SUN1/emerin的聚集、核孔复合物的扭曲，并通过增强F-肌动蛋白的偶联作用增加核纤层刚性。早衰蛋白通过隔离DNA修复因子（导致持续存在的53BP1/γH2AX聚集灶）、消耗异染色质（H3K9me3丢失、核纤层相关结构域的重定位）以及维持DNA损伤信号通路（ATM/ATR-Chk1/2-p53-p21介导的衰老）来破坏核结构和基因组的维持。它还会损害 Wnt/β-catenin 信号传导，影响细胞骨架-核连接（通过异常的 LINC 复合物失调 ERK1/2），并导致血管平滑肌、脂肪细胞和成骨细胞的细胞耗竭和丢失，临床表现为早衰综合征 (HGPS) 的早衰表型，包括脂肪营养不良、骨溶解和动脉粥样硬化。

特异性

Progerin Antibody [J17D10] 可检测内源性 Progerin 总蛋白水平。

背景

早衰蛋白（层粘蛋白AΔ50）是一种致病性的607个氨基酸的法尼基化截短突变体，由LMNA基因中一个隐蔽剪接位点的激活（c.1824C>T，G608G）产生，该位点消除了正常层粘蛋白A成熟所需的ZMPSTE24切割位点。因此，早衰蛋白保留了C端CaaX（CSIM）法尼基化基序，但缺失了647-656位氨基酸残基，从而阻止了去法尼基化，导致其永久锚定于核内膜。早衰蛋白的N端头部、中央α螺旋杆状结构域和Ig折叠结构域与野生型核纤层蛋白A/C相似，但其异常的法尼基化作用会促进毒性聚集体的形成、SUN1/emerin的聚集、核孔复合物的扭曲，并通过增强F-肌动蛋白的偶联作用增加核纤层刚性。早衰蛋白通过隔离DNA修复因子（导致持续存在的53BP1/γH2AX聚集灶）、消耗异染色质（H3K9me3丢失、核纤层相关结构域的重定位）以及维持DNA损伤信号通路（ATM/ATR-Chk1/2-p53-p21介导的衰老）来破坏核结构和基因组的维持。它还会损害 Wnt/β-catenin 信号传导，影响细胞骨架-核连接（通过异常的 LINC 复合物失调 ERK1/2），并导致血管平滑肌、脂肪细胞和成骨细胞的细胞耗竭和丢失，临床表现为早衰综合征 (HGPS) 的早衰表型，包括脂肪营养不良、骨溶解和动脉粥样硬化。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:10000

反应性

Human

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

74 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HeLa (stably expressing Flag-tagged human Progerin)