PTBP1 Antibody [L20G7] Datasheet

生物描述

特异性	PTBP1 Antibody [L20G7] 可检测内源性 PTBP1 总蛋白水平。
背景	PTBP1（多嘧啶序列结合蛋白1）是一种普遍表达的PTB家族RNA结合蛋白，它通过结合前体mRNA上的多嘧啶序列来抑制选择性外显子剪接，从而调控神经分化、细胞增殖和致癌通路。PTBP1具有N端核定位信号/核输出信号（NLS/NES）和四个异质的RNA结合结构域（RRM1-4），呈“串珠状”排列，并由柔性连接肽连接（RRM1后42个氨基酸，RRM2后58-84个氨基酸）。每个RRM的αβ三明治结构通过不同的疏水口袋结合富含U/C的序列（RRM1：L89/L91/F98/H133/L136；RRM2：I214/F216/L225/S258）。 PTBP1 的主要功能是抑制 PKM 等外显子的剪接（尤其偏好与癌症相关的 PKM2），其 RRM3-4 形成一个刚性双结构域，可调控 RNA 结构，而 RRM1/2 则独立运动以确保特异性；PTBP1 能与 U2AF65 竞争，并募集辅助因子 Raver1/Matrin3，从而比神经同源物 PTBP2 发挥更强的抑制作用。它维持上皮细胞的特性，阻断非神经元细胞中的神经元基因表达（PTBP1→PTBP2 转换可促进神经发生），并通过 PKM2/CDK6/EXOC7 外显子插入促进糖酵解/增殖/侵袭，从而驱动癌症发生；在预后不良的癌症中过表达。PTBP1 与多种疾病相关，包括胶质母细胞瘤（PTBP1 抑制可诱导神经源性间质转化），以及通过反义寡核苷酸逆转致癌剪接的治疗靶点。

特异性

PTBP1 Antibody [L20G7] 可检测内源性 PTBP1 总蛋白水平。

背景

PTBP1（多嘧啶序列结合蛋白1）是一种普遍表达的PTB家族RNA结合蛋白，它通过结合前体mRNA上的多嘧啶序列来抑制选择性外显子剪接，从而调控神经分化、细胞增殖和致癌通路。PTBP1具有N端核定位信号/核输出信号（NLS/NES）和四个异质的RNA结合结构域（RRM1-4），呈“串珠状”排列，并由柔性连接肽连接（RRM1后42个氨基酸，RRM2后58-84个氨基酸）。每个RRM的αβ三明治结构通过不同的疏水口袋结合富含U/C的序列（RRM1：L89/L91/F98/H133/L136；RRM2：I214/F216/L225/S258）。 PTBP1 的主要功能是抑制 PKM 等外显子的剪接（尤其偏好与癌症相关的 PKM2），其 RRM3-4 形成一个刚性双结构域，可调控 RNA 结构，而 RRM1/2 则独立运动以确保特异性；PTBP1 能与 U2AF65 竞争，并募集辅助因子 Raver1/Matrin3，从而比神经同源物 PTBP2 发挥更强的抑制作用。它维持上皮细胞的特性，阻断非神经元细胞中的神经元基因表达（PTBP1→PTBP2 转换可促进神经发生），并通过 PKM2/CDK6/EXOC7 外显子插入促进糖酵解/增殖/侵袭，从而驱动癌症发生；在预后不良的癌症中过表达。PTBP1 与多种疾病相关，包括胶质母细胞瘤（PTBP1 抑制可诱导神经源性间质转化），以及通过反义寡核苷酸逆转致癌剪接的治疗靶点。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	CHIP
1:1000	1:100	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

57 kDa, 59 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: C6, Lane 4: COS-7