PTK7/CCK4 Antibody [B13K12] Datasheet

生物描述

特异性	PTK7/CCK4 Antibody [B13K12] 可检测内源性 PTK7/CCK4 总蛋白水平。
背景	PTK7，又名CCK4，属于受体酪氨酸激酶家族，但由于其激酶样结构域中缺少关键残基，因此缺乏催化激酶活性。该蛋白由约1070个氨基酸组成，其胞外区包含七个免疫球蛋白样（Ig）结构域（环1-7）、一个跨膜螺旋，以及一个由345个氨基酸残基组成的胞内区，该胞内区包含一个无菌α基序（SAM）和一个催化失活的酪氨酸激酶同源结构域。Ig结构域1-7介导配体非依赖性的同源二聚化和异源相互作用，而激酶结构域由于缺少用于Mg2+螯合的DFG基序，则起到支架蛋白结合的作用。 PTK7 通过其 PDZ 结合基序募集 Dishevelled (Dsh) 至 Frizzled 受体，从而调控平面细胞极性 (PCP)。Dsh 与 RACK1 和 RACK1 共同激活非经典 Wnt/PCP 信号通路，促进趋同延伸、神经管闭合和神经嵴细胞迁移。在经典 Wnt 信号通路中，PTK7 与 Frizzled 竞争结合位点，抑制 β-catenin 的稳定和转录。MMP14（Pro621-Leu622 之间）和 ADAM17 的蛋白水解切割可去除胞外结构域，释放出可溶性片段，该片段可促进细胞增殖、迁移和侵袭，同时生成膜残基以增强信号传导。PTK7 在胚胎发生、上皮组织、轴突导向和血管生成过程中调控细胞黏附、极性、运动、肌动蛋白重组和细胞凋亡。 PTK7与Plexin-A1共同参与信号通路，调控细胞骨架动力学，并与VEGFR1共同参与血管生成。在癌症中，PTK7上调通过激活PCP和稳定EGFR，促进结肠癌、胃癌、肺癌和卵巢癌的转移；V354M种系变异体可提高PTK7水平，抑制p53/p21/CREB信号通路，并增强AKT活性，从而促进细胞增殖。PTK7是急性髓系白血病预后不良的标志，也是抗体药物偶联物（ADC）的靶点。膜转运和Cdx调控的表达精细调控着PTK7在发育和肿瘤发生中的作用。

特异性

PTK7/CCK4 Antibody [B13K12] 可检测内源性 PTK7/CCK4 总蛋白水平。

背景

PTK7，又名CCK4，属于受体酪氨酸激酶家族，但由于其激酶样结构域中缺少关键残基，因此缺乏催化激酶活性。该蛋白由约1070个氨基酸组成，其胞外区包含七个免疫球蛋白样（Ig）结构域（环1-7）、一个跨膜螺旋，以及一个由345个氨基酸残基组成的胞内区，该胞内区包含一个无菌α基序（SAM）和一个催化失活的酪氨酸激酶同源结构域。Ig结构域1-7介导配体非依赖性的同源二聚化和异源相互作用，而激酶结构域由于缺少用于Mg2+螯合的DFG基序，则起到支架蛋白结合的作用。 PTK7 通过其 PDZ 结合基序募集 Dishevelled (Dsh) 至 Frizzled 受体，从而调控平面细胞极性 (PCP)。Dsh 与 RACK1 和 RACK1 共同激活非经典 Wnt/PCP 信号通路，促进趋同延伸、神经管闭合和神经嵴细胞迁移。在经典 Wnt 信号通路中，PTK7 与 Frizzled 竞争结合位点，抑制 β-catenin 的稳定和转录。MMP14（Pro621-Leu622 之间）和 ADAM17 的蛋白水解切割可去除胞外结构域，释放出可溶性片段，该片段可促进细胞增殖、迁移和侵袭，同时生成膜残基以增强信号传导。PTK7 在胚胎发生、上皮组织、轴突导向和血管生成过程中调控细胞黏附、极性、运动、肌动蛋白重组和细胞凋亡。 PTK7与Plexin-A1共同参与信号通路，调控细胞骨架动力学，并与VEGFR1共同参与血管生成。在癌症中，PTK7上调通过激活PCP和稳定EGFR，促进结肠癌、胃癌、肺癌和卵巢癌的转移；V354M种系变异体可提高PTK7水平，抑制p53/p21/CREB信号通路，并增强AKT活性，从而促进细胞增殖。PTK7是急性髓系白血病预后不良的标志，也是抗体药物偶联物（ADC）的靶点。膜转运和Cdx调控的表达精细调控着PTK7在发育和肿瘤发生中的作用。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:200

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

160 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A204, Lane 2: C2C12, Lane 3: PC12