Pumilio 2 Antibody (Rabbit mAb) [P14B5]

目录号：F2795

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生物描述

特异性 Pumilio 2 Antibody (Rabbit mAb) [P14B5] 可检测内源性 Pumilio 2 总蛋白水平。
背景 Pumilio 2 (PUM2) 是高度保守的 PUF 家族序列特异性 RNA 结合蛋白的成员，主要作为转录后调控因子发挥作用。PUM2 结合靶 mRNA 3′ 非翻译区中的特定基序，从而调控其在多种哺乳动物组织中的翻译和稳定性，尤其在生殖细胞、干细胞和神经系统中表达强烈。PUM2 包含一个特征性的 C 端 Pumilio 同源结构域，该结构域由重复的 α 螺旋单元组成，每个 α 螺旋单元与单个核苷酸结合，形成一个延伸的 RNA 结合表面，该表面能够识别 Pumilio 反应元件，并将相关的效应分子定位，从而抑制或激活翻译。在小鼠神经系统中，Pumilio-2 与突触处的树突 mRNA 结合，并作为翻译调节因子发挥作用，通过限制特定离子通道和信号蛋白的局部合成来塑造树突形态发生、分支和内在兴奋性，从而有助于维持神经元稳态并微调突触反应性。体内 Pum2 的缺失会导致树突分支改变和神经元放电特性改变，这与其在设定兴奋性阈值和调节树突区室内的协同 mRNA 翻译中的作用相一致，而这些区室对于回路功能和可塑性至关重要。在胚胎干细胞中，Pum1 和 Pum2 形成一个转录后调控网络，直接调控超过一千种 mRNA，包括参与多能性、分化和细胞周期控制的因子；在这个网络中，Pum2 通过促进关键干性转录本的表达或稳定性来维持自我更新和多能性，同时抑制分化程序，这与倾向于驱动分化的 Pum1 形成对比。Pum1 和 Pum2 参与一个负反馈环路，彼此结合对方的 mRNA，并针对不同的靶点使用多种机制，不仅包括经典的翻译抑制，还包括增强翻译和调节 mRNA 周转，这使得 PUM2 处于一个多功能转录后调控中心，协调干细胞状态和早期胚胎发育。实验中 Pum1 和 Pum2 的双敲除会导致胚胎干细胞自我更新严重受损、分化缺陷和早期胚胎致死，而单基因缺失则会产生不同的表型，其中 Pum2 缺陷会导致多能性标记物减少和分化加速，这进一步证实了 PUM2 在维持多能性转录组方面的功能特化。在人类脂肪来源干细胞中，PUMILIO-2通过抑制限制细胞周期的特定靶mRNA来促进细胞增殖的正向调控，这凸显了其在平衡成体干细胞区室的增殖和分化中的作用，并提示PUM2活性的调节可以改变细胞的再生或增殖能力。在通路层面，PUM2整合到更广泛的RNA调控回路中，包括microRNA和长链非编码RNA，它结合靶标3′UTR并与miRNA复合物协同或拮抗，在某些情况下，它还通过控制编码有丝分裂和DNA修复因子的转录本来参与维护基因组稳定性的程序。PUM2表达或活性的失调与多种癌症相关，其中Pumilio水平的改变与肿瘤进展和预后相关。 PUM2 与 miRNA、lncRNA 和 circRNA 参与调控轴，调节癌基因和抑癌基因的表达；在结直肠癌和肝细胞癌模型中，PUM2 通过维持增殖信号和抑制细胞凋亡来促进肿瘤生长和存活。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:5000 - 1:10000 1:10 - 1:20 1:50 1:30
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 114 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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