Rabbit IgG Isotype Control Antibody (Rabbit mAb) [D24D4]

目录号：F2665

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生物描述

特异性

Rabbit IgG Isotype Control Antibody (Rabbit mAb) [D24D4] 可用作兔 IgG 抗体的同型对照。
背景

兔IgG同型对照抗体是免疫球蛋白G类兔抗体，其恒定区和Y形结构与靶标特异性兔IgG相同，包括成对的重链和轻链，以及能够与Fc受体和补体结合的Fc区，而Fab区则缺乏对测试系统中抗原的特异性。Fc区保留了与Fcγ受体结合、与Fc结合蛋白相互作用以及参与非抗原驱动的与细胞脂质、碳水化合物和细胞外基质成分结合的能力，而Fab区则不识别待测表位，因此其非特异性结合谱与典型的兔一抗相当，且不产生靶向信号。在实验条件下，兔IgG同型对照抗体用作阴性对照，以确定由Fc受体结合、弱蛋白-蛋白或蛋白-表面相互作用以及荧光染料或酶偶联物引起的背景信号。其使用浓度与待测抗体相同，包括免疫球蛋白类别、亚类和浓度，以确保二者具有相同的亲和力、Fc相互作用和标记密度。在流式细胞术、免疫组织化学和免疫荧光实验中，同型对照IgG与白细胞和组织驻留免疫细胞上的Fc受体结合，并与非特异性位点结合，其程度与典型的兔一抗相同，从而可以直接比较同型对照和待测抗体通道之间的信号，并建立一个阈值，将特异性抗原依赖性染色与背景信号区分开来。在染色质免疫沉淀（RIP）、酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫沉淀实验中，正常兔IgG作为基质结合和染色质结合对照，用于检测在与抗原特异性抗体相同的条件下，核酸和蛋白质在支持表面上的非表位定向捕获情况。兔IgG的恒定区结构使其能够被抗兔二抗以及蛋白A或蛋白G识别，从而使兔IgG同型对照能够整合到检测和纯化系统中，并报告来自二抗、酶或荧光标记物或捕获基质的信号。在使用直接偶联兔抗体的多参数流式细胞术分析中，偶联的兔IgG同型对照与荧光染料、同型和浓度相匹配，能够量化荧光染料相关和Fc介导的相互作用产生的背景信号，并允许根据该基线设置门控和阳性阈值。在这些应用中，兔IgG同型对照通过区分真正的抗原依赖性信号和由Fc-配体相互作用和非特异性吸附引起的噪声，增强了在Fc受体阳性细胞丰富或具有高固有自发荧光的样本中的检测稳健性。在以抗体读数为依据的疾病导向和转化研究中，兔 IgG 同型对照为解释生物标志物表达水平和分布提供了参考，确保归因于病理的染色模式并非仅由 Fc 受体表达或基质成分的改变所解释。

使用信息

抗体应用 IP, IHC, IF, FCM, ChIP 稀释比例
反应性
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 '-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data