RBPSUH Antibody (Rabbit mAb) [M13J4]

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生物描述

特异性 RBPSUH Antibody (Rabbit mAb) [M13J4] 可检测内源性 RBPSUH 总蛋白水平。
背景 RBPSUH，也称为 RBPJ、CSL 或 CBF1，是 CSL 家族的序列特异性 DNA 结合转录因子，作为经典 Notch 信号通路的核效应因子，在多种脊椎动物组织中独立于 Notch 调控基因表达。该蛋白包含一个 N 端结构域、一个中央 β-三叶草结构域和一个 C 端结构域，这些结构域共同构成识别 GTGGGAA 型共有基序的表面，并为核心抑制因子、Notch 胞内结构域和共激活因子提供结合位点。在配体未激活 Notch 的情况下，RBPJK 占据染色质上的相应基序，并与包含 SHARP 和组蛋白去乙酰化酶的核心抑制复合物结合，指导组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸的去乙酰化，从而维持 Notch 响应启动子和增强子处于转录抑制状态。配体诱导的Notch受体裂解产生Notch胞内结构域，该结构域通过其RAM和锚蛋白区域与RBPJK结合，并募集Mastermind样共激活因子形成激活复合物。该复合物稳定RBPJK在DNA上的结合，吸引组蛋白乙酰转移酶，促进H3K27乙酰化，并增强靶位点RNA聚合酶II的活性。RBPJK结合位点的这种共因子交换与抑制元件转化为转录活性调控区域以及经典Notch靶基因（如Hes和Hey家族基因）的转录增强相关，此外，全基因组分析还鉴定出其他一些与环境相关的靶基因。RBPJK的结合界定了具有动态H3K27乙酰化循环的调控元件簇，这些循环与脉冲式Notch活性以及Notch依赖性转录反应幅度的时序变化相关。全基因组图谱显示，RBPJK 的结合范围远超经典的 Notch 反应基因，甚至包括 Notch 信号通路活性极低时检测到的位点。在这些位点，RBPJK 与其他转录调控因子共同占据调控区域，并标记细胞类型特异性转录网络的组成部分。RBPJK 依赖的 Notch 信号通路调控与细胞增殖、存活和分化相关的基因表达程序，包括 T 细胞发育和祖细胞维持所需的程序。在 T 细胞急性淋巴细胞白血病和其他 Notch 驱动的癌症中，NOTCH1 和 RBPJK 在表达基因附近的调控元件处形成染色质结合复合物，这些基因支持白血病细胞的特性。在这些情况下，RBPJK 作为 Notch 依赖性转录调控的直接 DNA 结合平台，具有作为 Notch 信号通路药物调控靶点的潜力。

使用信息

抗体应用 WB, IF, FCM 稀释比例
WB IF FCM
1:1000-1:10000 1:50 1:50
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 56 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量预热的 Hot 1% SDS Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），90 - 95℃热裂解10min, 期间用移液枪反复吹打重悬细胞，确保细胞与热裂解液充分接触。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: 293, Lane 2: PC-12, Lane 3: NIH/3T3, Lane 4: Raw264.7