Reg3B Antibody (Rat mAb) [C3N11] Datasheet

生物描述

特异性	Reg3B Antibody (Rat mAb) [C3N11] 可检测内源性 Reg3B 总蛋白水平。
背景	再生胰岛衍生蛋白3β (Reg3B)，又称胰腺炎相关蛋白1 (PAP1) 或肝癌-肠-胰腺蛋白 (HIP)，属于分泌型C型凝集素结构域蛋白Reg家族，具有多种功能，包括抗菌防御、组织修复和细胞信号传导。Reg3B以含有N端前肽的前体蛋白形式分泌，该前肽使蛋白处于非活性状态。随后，胰蛋白酶水解去除该抑制片段，生成成熟的杀菌形式，该形式能够与肽聚糖结合并发挥抗菌活性。该蛋白质在小肠的潘氏细胞和神经内分泌细胞、胰腺腺泡和胰岛β细胞以及中枢神经系统发育中的运动和感觉神经元中表现出组织特异性表达，其表达模式受炎症细胞因子（包括白细胞介素-6和白细胞介素-22）的动态调节，通过Toll样受体2（TLR2）激活下游的信号转导和转录激活因子3（STAT3）依赖性机制进行调节。 Reg3B作为一种激素样信号分子，通过与其受体外骨蛋白样糖基转移酶3 (EXTL3) 结合，激活RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，进而驱动腺泡-导管化生 (ADM)，ADM是胰腺导管腺癌的前体病变。在胰泌素诱导的胰腺炎模型中，转基因Reg3B的表达会促进ADM的持续发展，并最终进展为胰腺上皮内瘤变 (PanIN)。Reg3B的抗菌功能是通过直接结合革兰氏阴性菌脂多糖的脂质A部分以及识别革兰氏阳性菌的肽聚糖来实现的，从而破坏细菌膜并导致细菌死亡。然而，某些细菌多糖，例如鼠伤寒沙门氏菌的O抗原，会阻止Reg3B的结合，并赋予细菌对其杀菌活性的耐药性。在肠道炎症（包括由致病菌感染引发的结肠炎和炎症性肠病）期间，Reg3B 的表达上调。该蛋白通过限制细菌从肠腔向肠道组织和肠外部位的转移，减轻回肠炎和结肠炎的严重程度，从而使 Reg3B 成为维持肠道屏障完整性和宿主-微生物稳态的保护因子。该蛋白的功能取决于组织环境，呈现出矛盾的特点：在胰腺中，它促进雪旺氏细胞增殖，并支持受损神经元在再生过程中依赖于睫状神经营养因子的存活；同时，它通过诱导包括骨桥蛋白和应激反应性核蛋白 p8 在内的胰岛保护基因，保护胰岛β细胞免受链脲佐菌素诱导的死亡和炎症；然而，在肿瘤微环境中，Reg3B 促进肿瘤生长和血管生成，同时抑制肿瘤相关巨噬细胞和 T 细胞介导的炎症反应。 Reg3B通过促进巨噬细胞的迁移、增殖以及向抗炎性M2样极化（其特征是精氨酸酶-1、甘露糖受体C型1、几丁质酶样蛋白3和抵抗素样蛋白α表达升高）来调控巨噬细胞的功能表型，这有助于炎症消退，但也可能促进肿瘤免疫逃逸。该蛋白与NF-κB信号通路中的组分相互作用，影响其他抗菌肽和防御素的转录，从而协调更广泛的抗菌反应，超越其直接的杀菌作用。Reg3B独立发挥作用，而非形成多亚基复合物，它作为一种可溶性效应蛋白分泌到肠腔和细胞外空间，在那里它可以接触细菌靶点并与细胞表面受体结合。

特异性

Reg3B Antibody (Rat mAb) [C3N11] 可检测内源性 Reg3B 总蛋白水平。

背景

再生胰岛衍生蛋白3β (Reg3B)，又称胰腺炎相关蛋白1 (PAP1) 或肝癌-肠-胰腺蛋白 (HIP)，属于分泌型C型凝集素结构域蛋白Reg家族，具有多种功能，包括抗菌防御、组织修复和细胞信号传导。Reg3B以含有N端前肽的前体蛋白形式分泌，该前肽使蛋白处于非活性状态。随后，胰蛋白酶水解去除该抑制片段，生成成熟的杀菌形式，该形式能够与肽聚糖结合并发挥抗菌活性。该蛋白质在小肠的潘氏细胞和神经内分泌细胞、胰腺腺泡和胰岛β细胞以及中枢神经系统发育中的运动和感觉神经元中表现出组织特异性表达，其表达模式受炎症细胞因子（包括白细胞介素-6和白细胞介素-22）的动态调节，通过Toll样受体2（TLR2）激活下游的信号转导和转录激活因子3（STAT3）依赖性机制进行调节。 Reg3B作为一种激素样信号分子，通过与其受体外骨蛋白样糖基转移酶3 (EXTL3) 结合，激活RAS-RAF-MEK-ERK信号通路，进而驱动腺泡-导管化生 (ADM)，ADM是胰腺导管腺癌的前体病变。在胰泌素诱导的胰腺炎模型中，转基因Reg3B的表达会促进ADM的持续发展，并最终进展为胰腺上皮内瘤变 (PanIN)。Reg3B的抗菌功能是通过直接结合革兰氏阴性菌脂多糖的脂质A部分以及识别革兰氏阳性菌的肽聚糖来实现的，从而破坏细菌膜并导致细菌死亡。然而，某些细菌多糖，例如鼠伤寒沙门氏菌的O抗原，会阻止Reg3B的结合，并赋予细菌对其杀菌活性的耐药性。在肠道炎症（包括由致病菌感染引发的结肠炎和炎症性肠病）期间，Reg3B 的表达上调。该蛋白通过限制细菌从肠腔向肠道组织和肠外部位的转移，减轻回肠炎和结肠炎的严重程度，从而使 Reg3B 成为维持肠道屏障完整性和宿主-微生物稳态的保护因子。该蛋白的功能取决于组织环境，呈现出矛盾的特点：在胰腺中，它促进雪旺氏细胞增殖，并支持受损神经元在再生过程中依赖于睫状神经营养因子的存活；同时，它通过诱导包括骨桥蛋白和应激反应性核蛋白 p8 在内的胰岛保护基因，保护胰岛β细胞免受链脲佐菌素诱导的死亡和炎症；然而，在肿瘤微环境中，Reg3B 促进肿瘤生长和血管生成，同时抑制肿瘤相关巨噬细胞和 T 细胞介导的炎症反应。 Reg3B通过促进巨噬细胞的迁移、增殖以及向抗炎性M2样极化（其特征是精氨酸酶-1、甘露糖受体C型1、几丁质酶样蛋白3和抵抗素样蛋白α表达升高）来调控巨噬细胞的功能表型，这有助于炎症消退，但也可能促进肿瘤免疫逃逸。该蛋白与NF-κB信号通路中的组分相互作用，影响其他抗菌肽和防御素的转录，从而协调更广泛的抗菌反应，超越其直接的杀菌作用。Reg3B独立发挥作用，而非形成多亚基复合物，它作为一种可溶性效应蛋白分泌到肠腔和细胞外空间，在那里它可以接触细菌靶点并与细胞表面受体结合。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:500

反应性

Mouse

抗体类型

Rat Monoclonal Antibody

MW

17 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:250），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Mouse small intestine