RNF40 Antibody (Rabbit mAb) [A17P16]

目录号：F6510

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生物描述

特异性 RNF40 Antibody (Rabbit mAb) [A17P16] 可检测内源性 RNF40 总蛋白水平。
背景 RNF40 是一种 RING 指 E3 泛素连接酶，它与其旁系同源物 RNF20 形成稳定的异二聚体，构成哺乳动物中负责组蛋白 H2B 赖氨酸 120 单泛素化的主要复合物。这种修饰通过影响下游组蛋白 H3K4 和 H3K79 的甲基化、转录延伸和增强子活性，以依赖于上下文的方式塑造组蛋白密码并控制转录程序。RNF20/40 复合物包含多个卷曲螺旋区域，这些区域介导异二聚化和与染色质相关因子的相互作用；RNF40 的 C 端 RING 结构域可与 E2 泛素结合酶（如 UBE2A/UBE2B）结合，催化活跃转录区域的 H2B 单泛素化。在小鼠胚胎成纤维细胞中条件性敲除 Rnf40 会选择性地影响 H2Bub1 水平较低至中等的基因。这些 RNF40 依赖性基因表达的降低与 H3K4me3 峰的变窄和转录延伸的减少相关，而 H2Bub1 水平较高的基因则基本保持不变。RNF40 的缺失还会导致一部分富含 H3K27me3 的基因表达上调，这是由于 Ezh2 甲基转移酶的表达降低所致。这种表观遗传改变伴随着某些位点上 FOXL2 介导的增强子激活。这表明，RNF40 控制的 H2Bub1 可以根据周围染色质结构以及与其他组蛋白修饰和调控因子的相互作用，促进或抑制转录。在卡波西肉瘤相关疱疹病毒 (KSHV) 感染的背景下，RNF40 和 RNF20 被病毒的早期转录因子 RTA/ORF50 直接利用：蛋白质组学分析发现 RTA 与 RNF20/40 复合物之间存在特异性相互作用，而对 RNF20/40 活性的基因或药理学干扰会降低 RTA 诱导的裂解性再激活，降低包括 RTA 自身和其他复制因子在内的裂解基因的表达，并减少感染性病毒颗粒的产生，这表明 RTA 利用宿主 H2B 泛素连接酶来重塑裂解启动子处的染色质，并驱动从潜伏期到裂解周期的转换。因此，RNF40 将核心表观遗传修饰——H2BK120ub1——与宿主基因调控和病毒生命周期控制联系起来，在基础条件下参与基于染色质的发育和组织特异性转录调控，并被 KSHV RTA 募集以在受感染的 B 细胞中强制病毒裂解基因表达，这种机制支持病毒传播并促进 KSHV 相关恶性肿瘤的发病机制。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:80 1:100
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 114 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: HeLa, Lane 2: C6, Lane 3: RAW 264.7, Lane 4: PC-12