Robo1 Antibody [A23H22] Datasheet

生物描述

特异性	Robo1 Antibody [A23H22] 可检测内源性 Robo1 总蛋白水平。
背景	Robo1，又称环状导向受体1（Roundabout guidance receptor 1），也称为DUTT1，是Robo家族单次跨膜糖蛋白的创始成员，介导Slit依赖性排斥作用，该作用对中线轴突导向、神经元迁移和组织形态发生至关重要。其胞外结构域包含五个免疫球蛋白样结构域Ig1至Ig5，其中Ig1和Ig2构成主要的Slit2-D2结合位点，并通过Ig4接触组装成紧密的二聚体或四聚体，硫酸乙酰肝素与Ig1和Ig2的结合进一步增强了其刚性。其后是三个富含半胱氨酸的纤连蛋白III型结构域Fn1至Fn3，其中Fn2和Fn3靠近细胞膜以定位于细胞表面；此外还有一个跨膜结构域和一个约150个氨基酸的胞内结构域，该胞内结构域包含四个保守的CC0至CC3基序。 CC2 和 CC3 基序募集 Abelson 激酶和 Dock 蛋白，从而抑制细胞骨架的排斥作用；而 CC1 则介导 LogR 和 DCC 的拮抗作用。Robo1 的核心功能在于 Slit2 诱导的信号传导，其中三元 Slit2N-Ig1-硫酸乙酰肝素复合物触发 Robo1 寡聚化，且不引起明显的构象变化。胞质 CC 基序募集 Dock 和 ELMO，进而激活 Rac1 和 CDC42，激活 Arp2/3 和 WAVE 复合物，并在生长锥和前缘处引发分支状 F-肌动蛋白介导的排斥作用，从而抑制 Netrin 和 DCC 的吸引，并建立细胞的前后边界。 Robo1通过促进中线跨越后的前转来调控连合轴突的模式形成，将神经胶质细胞限制在中线附近，控制肺和肾脏的血管分支，并调节肿瘤细胞迁移。Robo1、Robo2、Robo3和Robo4之间的冗余性确保了发育的稳健性。Robo1的过度甲基化或突变导致的表观遗传沉默会通过增强侵袭性促进乳腺癌和肺癌的转移，加速神经胶质瘤的进展，并通过神经回路缺陷导致自闭症。而Slit2-Robo1通路的重新激活则能恢复肿瘤抑制功能。

特异性

Robo1 Antibody [A23H22] 可检测内源性 Robo1 总蛋白水平。

背景

Robo1，又称环状导向受体1（Roundabout guidance receptor 1），也称为DUTT1，是Robo家族单次跨膜糖蛋白的创始成员，介导Slit依赖性排斥作用，该作用对中线轴突导向、神经元迁移和组织形态发生至关重要。其胞外结构域包含五个免疫球蛋白样结构域Ig1至Ig5，其中Ig1和Ig2构成主要的Slit2-D2结合位点，并通过Ig4接触组装成紧密的二聚体或四聚体，硫酸乙酰肝素与Ig1和Ig2的结合进一步增强了其刚性。其后是三个富含半胱氨酸的纤连蛋白III型结构域Fn1至Fn3，其中Fn2和Fn3靠近细胞膜以定位于细胞表面；此外还有一个跨膜结构域和一个约150个氨基酸的胞内结构域，该胞内结构域包含四个保守的CC0至CC3基序。 CC2 和 CC3 基序募集 Abelson 激酶和 Dock 蛋白，从而抑制细胞骨架的排斥作用；而 CC1 则介导 LogR 和 DCC 的拮抗作用。Robo1 的核心功能在于 Slit2 诱导的信号传导，其中三元 Slit2N-Ig1-硫酸乙酰肝素复合物触发 Robo1 寡聚化，且不引起明显的构象变化。胞质 CC 基序募集 Dock 和 ELMO，进而激活 Rac1 和 CDC42，激活 Arp2/3 和 WAVE 复合物，并在生长锥和前缘处引发分支状 F-肌动蛋白介导的排斥作用，从而抑制 Netrin 和 DCC 的吸引，并建立细胞的前后边界。 Robo1通过促进中线跨越后的前转来调控连合轴突的模式形成，将神经胶质细胞限制在中线附近，控制肺和肾脏的血管分支，并调节肿瘤细胞迁移。Robo1、Robo2、Robo3和Robo4之间的冗余性确保了发育的稳健性。Robo1的过度甲基化或突变导致的表观遗传沉默会通过增强侵袭性促进乳腺癌和肺癌的转移，加速神经胶质瘤的进展，并通过神经回路缺陷导致自闭症。而Slit2-Robo1通路的重新激活则能恢复肿瘤抑制功能。

使用信息

抗体应用

WB, IP, FCM

稀释比例

WB	IP	FCM
1:1000	1:30	1:500

反应性

Mouse, Rat, Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

181 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: Hela (KO ROBO1), Lane 3: Mouse brain, Lane 4: Rat brain