SATB2 Antibody [C16D1]

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生物描述

特异性 SATB2 Antibody [C16D1] 可检测内源性 SATB2 总蛋白水平。
背景 SATB2（特殊富含AT序列结合蛋白2）是SATB家族的一种MAR结合核蛋白，它作为高级染色质组织者和转录调控因子，整合长程染色质结构与基因表达程序，调控颅面和骨骼发育、新皮层投射神经元特性、造血分化和肿瘤发生。该蛋白包含两个CUT结构域和一个同源异型结构域，嵌入于低复杂度的N端区域，这些结构域将SATB2锚定于富含AT序列的基质附着区元件，并募集染色质修饰因子和转录共调控因子，从而使SATB2能够组装调控中心，将远端基因组元件环化成功能域，并根据相关辅助因子激活或抑制靶基因簇。在鳃弓和发育中的骨骼的成骨细胞谱系细胞中，SATB2 通过抑制后部 Hoxa2 的表达，并与成骨转录因子 Runx2 和 ATF4 协同作用诱导骨基质基因，从而促进成骨分化和颅面模式形成。其剂量对颅面形态发生和骨再生潜能具有关键影响，这使得 SATB2 成为一种具有骨缺损修复转化意义的成骨诱导因子。在发育中的大脑皮层中，SATB2 在胼胝体和部分皮层下投射神经元中表达，它与 MARs 和 Ctip2/Bcl11b 及其他皮质下行决定因子附近的调控区域结合，抑制皮层下身份程序，促进胼胝体投射神经元的命运，从而引导轴突靶向穿过胼胝体而不是沿皮质脊髓束向下投射。条件性敲除实验揭示了SATB2在深层皮层下投射神经元中的其他作用，其中早期瞬时SATB2表达对于皮质脊髓束的形成至关重要，这表明投射神经元亚类分化和轴突导向受到层级和时间依赖性的调控。对发育皮层中SATB2靶基因的全基因组定位鉴定出超过一千个下游效应基因，这些基因按时间顺序排列成不同的基因簇，包括轴突导向受体和配体，例如Plxnd1、Ntng1、Efnb2、Ephb1、Plxna2和Epha3，以及突触相关基因和转录因子Mef2c。这些结果表明SATB2处于调控轴突发生、突触发生和突触可塑性的调控网络顶端，并通过SATB2调控基因在神经发育障碍基因位点的富集，将SATB2剂量与认知和精神表型联系起来。在成年大脑皮层和海马体中，SATB2 存在于各层的锥体神经元中，其相互作用伙伴从发育过程中主要抑制的复合物转变为成熟过程中染色质结构和转录调节网络。在人类中，SATB2 相互作用的基因集受到高度限制，罕见的破坏性变异会导致严重的认知障碍，而常见的变异则有助于一般的认知能力，这强调了以 SATB2 为中心的染色质枢纽在人类认知中的重要性。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:50 1:600
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 83 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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